Entwicklung eines Hochs | Kunststofflager Inc.

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 22652 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Die Anwendung des 3D-Drucks in der biologischen Forschung hat der Tissue-Engineering-Community eine Methode zur Verfügung gestellt, um Zellen und biologische Materialien in komplexen 3D-Strukturen zu organisieren. Zwar gibt es viele kommerzielle Bioprinting-Plattformen, diese sind jedoch teuer und liegen zwischen 5.000 und über 1.000.000 US-Dollar. Diese hohen Eintrittskosten hindern viele Labore daran, 3D-Bioprinting in ihre Forschung einzubeziehen. Aufgrund des Open-Source-Charakters von Desktop-3D-Kunststoffdruckern besteht eine alternative Option darin, kostengünstige Kunststoffdrucker in Biodrucker umzuwandeln. Es wurden mehrere Open-Source-Modifikationen beschrieben, es besteht jedoch weiterhin Bedarf an einer benutzerfreundlichen Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Umwandlung eines Thermoplastdruckers in einen Biodrucker unter Verwendung von Komponenten mit validierter Leistung. Hier wandeln wir einen kostengünstigen 3D-Drucker, den FlashForge Finder, mit unserer Spritzenpumpe Replistruder 4 und dem Duet3D Duet 2 WiFi in einen Biodrucker um, für Gesamtkosten von weniger als 900 US-Dollar. Wir zeigen, dass die Genauigkeit der Bewegung des Biodruckers in allen drei Achsen besser als 35 µm ist, und quantifizieren die Genauigkeit, indem wir Kollagengerüste mit quadratischem Gitter mit durchschnittlichen Fehlern von weniger als 2 % drucken. Wir zeigen auch eine originalgetreue Reproduktion klinischer Bildgebungsdaten, indem wir ein Gerüst eines menschlichen Ohrs mit Kollagen-Biotinte drucken. Um die Zugänglichkeit und Anpassbarkeit zu maximieren, werden schließlich alle Komponenten, die wir für die Bioprinter-Konvertierung entwickelt haben, als Open-Source-3D-Modelle bereitgestellt, zusammen mit Anweisungen zur weiteren Modifikation des Bioprinters für zusätzliche Anwendungsfälle, was zu einem umfassenden Leitfaden für den Bioprinting-Bereich führt.

Die additive Fertigung hat in mehreren Branchen zu Umwälzungen geführt, da sie die Herstellung komplexer 3D-Teile, schnelle Designiterationen, kostengünstige Anpassungen und die Verwendung einer wachsenden Auswahl an Materialien in technischer Qualität ermöglicht1. Dieser Übergang wurde von Forschern unterstützt, die neue 3D-Druckmethoden entwickeln, und von Unternehmen, die 3D-Drucker im industriellen Maßstab für den Pulverbettdruck, die Küpenpolymerisation, das Binder-Jetting und die Materialextrusion (z. B. die Extrusion thermoplastischer Filamente) herstellen. Der 3D-Biodruck hat das Potenzial, unter Verwendung einiger dieser Techniken2,3,4 ähnliche Verbesserungen im Bereich der Gewebezüchtung zu erzielen, indem zellularisierte Konstrukte und potenziell funktionelle Gewebe und Organe aufgebaut werden5,6,7,8. Anstelle von Polymeren, Metallen oder Keramiken wird beim 3D-Biodruck die Biotinte gedruckt, wobei der hier verwendete Begriff Bioink Zellaufschlämmungen mit hoher Dichte, synthetische und natürliche Hydrogele, zellbeladene Hydrogele, Biomaterialtinten und Kombinationen davon umfasst . Da sich der 3D-Biodruck jedoch noch überwiegend im Forschungs- und Entwicklungsstadium befindet, behindern Hindernisse für eine breite Einführung die Innovation. Zu diesen Hindernissen zählen vor allem die hohen Kosten kommerzieller 3D-Bioprinting-Plattformen in Forschungsqualität, die zwischen 5.000 und über 1.000.000 US-Dollar liegen. Bei diesen Preisen sind in der Regel der Kauf von Kapitalausrüstung und dedizierte Mittel erforderlich, was den Zugang zu Kerneinrichtungen und gut ausgestatteten Forschungslabors einschränkt. Darüber hinaus lassen sich viele dieser 3D-Biodruckplattformen nur schwer ohne zusätzliche Kosten für kundenspezifische Anwendungen modifizieren, sind nur begrenzt mit neuen Biomaterialien kompatibel und verwenden proprietäre Drucksoftware und ein geschlossenes Hardware-Ökosystem.

Eine Lösung für diese Probleme entstand mit der Open-Source-3D-Druck-Community, die Anfang der 2000er Jahre begann und mit dem Auslaufen nationaler und internationaler Patente auf Fused Deposition Modeling (FDM) im Jahr 20099 beschleunigte. Zum ersten Mal ging der Kunststoff-3D-Druck von aus eine relativ teure Technik, bei der proprietäre Geräte und Materialien verwendet werden, die von großen Unternehmen dominiert werden, bis hin zu einer Open-Source-Bewegung, die von Startup-Unternehmen und kostengünstigen 3D-Druckern vorangetrieben wird, die von jedem genutzt werden können. Bereits 2012 begannen Forscher damit, diese kostengünstigen Thermoplastdrucker, die von der Open-Source-Community kontinuierlich verbessert wurden, in Biodrucker umzuwandeln, die hochwertige Ergebnisse für Zehntausende Dollar weniger als kommerzielle Alternativen liefern können. Ebenso zeigten frühe Arbeiten an maßgeschneiderten 3D-Biodruckern wie das fab@home-Projekt in Cornell das Potenzial der Entwicklung von Open-Source-Plattformen zu relativ geringen Kosten10. In diesem Zeitraum hat unsere Forschungsgruppe eine breite Palette von Open-Source-Thermoplastdruckern (z. B. MakerBot Replicator, LulzBot Mini 2, PrintrBot Simple Metal, FlashForge Creator Pro, MakerGear M2) in leistungsstarke 3D-Biodrucker umgewandelt11,12,13. Dadurch konnten wir das hochwertige 3-Achsen-Bewegungssystem nutzen, über das diese Open-Source-Drucker bereits verfügen, und mussten nur die Komponenten hinzufügen, wie z. B. den Spritzenpumpenextruder, die speziell für das Bioprinting von Zellen und flüssigen Biotinten erforderlich sind. Darüber hinaus verwendet unser Ansatz denselben Schrittmotor wie der ursprüngliche Filamentextruder des Thermoplastdruckers, um den Spritzenpumpenextruder des Biodruckers anzutreiben. Dies bedeutet, dass mehrere hochwertige Open-Source-Softwarepakete verwendet werden können, um 3D-Modelle in G-Code zu schneiden und den Druckprozess zu steuern, genau wie beim Kunststoffdruck.

Zwar gibt es mehrere Veröffentlichungen, die Modifikationen von 3D-Biodruckern beschreiben, einschließlich der von uns entwickelten Extruder12,14, insgesamt fehlt auf diesem Gebiet jedoch ein umfassender Leitfaden für den Aufbau einer vollständigen, anpassbaren Open-Source-Plattform für 3D-Biodrucker unter Verwendung validierter und getesteter Komponenten15,16,17. 18,19,20. Hier beschreiben wir die Modifikation eines kostengünstigen thermoplastischen 3D-Druckers, der weithin erhältlich ist, in einen Biodrucker für unter 1000 US-Dollar. Seit 2018 veranstalten wir einen international besuchten Open-Source-3D-Bioprinting-Workshop an der Carnegie Mellon University, bei dem die Teilnehmer ihren eigenen Bioprinter bauen, lernen, wie man ihn für den Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogel (FRESH) 3D-Bioprinting verwendet, und die Bioprinter dann zurücknehmen an ihre Heimatinstitutionen für zukünftige Forschung. Diese Bemühungen dienten der Validierung unserer Bioprinter-Designs und -Modifikationen sowie Schritt-für-Schritt-Anleitungen für unterschiedliche Benutzerhintergründe und Erfahrungsstufen und führten zu mehreren wirkungsvollen Veröffentlichungen21,22,23,24,25,26,27. Obwohl wir hier einen FlashForge Finder als Drucker verwenden, lässt sich der von uns beschriebene Ansatz problemlos an nahezu jeden kostengünstigen Open-Source-Extrusions-3D-Drucker auf dem Markt anpassen. Zu diesem Zweck haben wir Anweisungen erstellt, die nur minimale Kenntnisse in Elektronik oder mechanischer Fertigung erfordern, und verwenden zuvor veröffentlichte Open-Source-Druckerkomponenten und Spritzenpumpenextruder, mit denen hochwertige gedruckte Konstrukte hergestellt werden können14. Um eine einfache Einführung und zukünftige Anpassbarkeit zu gewährleisten, ersetzen wir die proprietäre Bewegungssteuerungsplatine des Finder durch Duet 2 WiFi, eine Open-Source-, hochgradig anpassungsfähige, benutzerfreundliche und sehr gut dokumentierte Bewegungssteuerungsplatine von Duet3D. Wir statten den Drucker außerdem mit unserer Open-Source-Spritzenpumpe Replistruder 4 aus, die auf fast einem Jahrzehnt an Entwürfen aus unserem Labor aufbaut und in mehreren veröffentlichten Studien12,14,21 verwendet wurde. Das Endergebnis ist ein kostengünstiger 3D-Biodrucker mit einer Leistung, die der von kommerziellen Alternativen ebenbürtig oder sogar überlegen ist und über ein hohes Maß an Anpassbarkeit von Hardware und Software verfügt, was für das Drucken neuer Biotinten und die Entwicklung fortschrittlicher Anwendungen von entscheidender Bedeutung ist.

Bei der Umwandlung eines 3D-Druckers aus Kunststoff in einen Biodrucker gibt es eine Abfolge von Schritten, die im Allgemeinen in der gleichen Reihenfolge ablaufen (Abb. 1). Zunächst muss die Elektronik und Steuerung des Kunststoffdruckers entweder durch Modifikation an das Bioprinting angepasst oder durch eine Alternative ersetzt werden. Die proprietäre FlashForge Finder-Bewegungssteuerungsplatine (Abb. 2A, grünes Rechteck) wird durch die Open-Source-Bewegungssteuerungsplatine Duet 2 WiFi (Abb. 2B, blaues Rechteck) ersetzt. Dies geschieht, um die Leistung der Bewegungssteuerung zu verbessern, WLAN-Zugriff bereitzustellen und eine schnelle Firmware-Anpassung über die webbasierte Duet-Schnittstelle zu ermöglichen, ohne dass zusätzliche Software verwendet werden muss. Die Schritt-für-Schritt-Anleitungen für diesen Vorgang sind für den FlashForge Finder ausgelegt und können für die meisten Desktop-3D-Drucker angepasst werden (Details finden Sie in der ergänzenden Montageanleitung, den ergänzenden Abbildungen S1–S15 und den bereitgestellten Duet2-WLAN-Konfigurationsdateien). Als nächstes wird der mit dem Drucker gelieferte Thermoplast-Extruder durch den Replistruder 4 ersetzt, einen Open-Source-Hochleistungs-Spritzenpumpen-Extruder, den wir zuvor entwickelt haben14. Die meisten Teile des Replistruder 4 lassen sich problemlos aus Kunststoff in 3D drucken und mit handelsüblicher Hardware zusammenbauen (Abb. 2C). Eine Schlittenplattform wurde so konzipiert, dass sie auf die vorhandenen Linearbewegungskomponenten des Druckers passt und einen Montagepunkt für den Replistruder 4 bietet. Dieser X-Achsen-Schlitten verfügt über Taschen für die bereits auf den X-Achsen-Linearschienen montierten Lager sowie Kanäle für Verlegen und Halten des X-Achsen-Riemens, der die Bewegung entlang der Achse antreibt. Darüber hinaus sind vier Befestigungspunkte mit versenkten M3-Sechskantmuttern integriert, um die Befestigung des Replistruder 4 am X-Achsen-Schlitten zu ermöglichen (Abb. 2D). Der thermoplastische Druckkopf, der auf dem Finder vorinstalliert ist, wird durch die X-Achsen-Schlitten/Replistruder 4-Baugruppe ersetzt (Abb. 2E, F, Einzelheiten in der ergänzenden Montageanleitung und ergänzende Abbildungen S16–S23). Nach Abschluss dieser Schritte wird der Replistruder 4 (Abb. 2G, blauer Pfeil) auf der X-Achse des Druckers im X-Achsen-Schlitten montiert (Abb. 2G, gelber Pfeil) und die Motoren werden mit dem Duet verbunden 2 WiFi, das im hinteren Schrank des Bioprinters positioniert ist (Abb. 2H, grüner Pfeil). Mit diesen Modifikationen wird der FlashForge Finder in einen Open-Source-Bioprinter mit Hochleistungsextruder und Bewegungssteuerungssystem umgewandelt.

Schritte zum Umrüsten eines Kunststoffdruckers in einen Biodrucker. Der Kunststoff-Extruder-Druckkopf und die Bewegungssteuerungsplatine des Kunststoffdruckers sind jeweils auf einen Spritzenpumpenextruder und eine Duet2-WiFi-Steuerungsplatine umgestellt. Das Duet2 WiFi wird dann für den Betrieb eines Bioprinters konfiguriert. Für den Biodruck wird das gewünschte 3D-Modell in Maschinenpfade geschnitten (mit der Cura Ultimaker-Software generierter G-Code) und dann führt Duet Web Control den Druck mit der gewünschten Biotinte aus. Abbildung teilweise mit BioRender.com erstellt.

Umwandlung des FlashForge-Finders in einen Bioprinter. (A) Die ursprüngliche Bewegungssteuerungsplatine und Verkabelung (grünes Rechteck). (B) Die Bewegungssteuerungsplatine wird durch die Duet 2 WiFi-Bewegungssteuerungsplatine (blaues Rechteck) ersetzt. (C) Der Spritzenpumpenextruder Replistruder 4 wird gedruckt und zusammengebaut. (D) Der X-Achsen-Schlitten für den FlashForge Finder wird 3D-gedruckt und der Replistruder 4 daran montiert. (E) Ansicht von oben nach unten auf den Kunststoff-Extruder-Druckkopf des Finder, der entfernt werden soll. (F) Ansicht des Replistruder 4 von oben nach unten, nachdem er im Drucker montiert wurde. (G) Zusätzliche Ansicht, die zeigt, dass der Kunststoff-Extruder-Druckkopf durch einen Replistruder 4-Spritzenpumpenextruder (blauer Pfeil) ersetzt wurde, der an einem benutzerdefinierten X-Achsen-Schlitten (gelber Pfeil) montiert ist. (H) Das Duet 2 WiFi ist in einem 3D-gedruckten Gehäuse montiert, das im hinteren Gehäuse des Finder abgedeckt ist (grüner Pfeil).

Der Duet 2 WiFi bietet mehrere entscheidende Vorteile gegenüber den serienmäßigen Bewegungssteuerungsplatinen, die im FlashForge Finder und anderen kostengünstigen Desktop-3D-Druckern zu finden sind. Erstens ermöglicht die WiFi-basierte Webschnittstelle des Duet einen einfachen Browser-Zugriff auf Druckerbewegungen, Dateispeicherung und -übertragung, Konfigurationseinstellungen und Firmware-Updates. Dies steht im Gegensatz zu den meisten 3D-Druckern, bei denen zum Bearbeiten der Konfigurationseinstellungen ein Flashen der Firmware der Bewegungssteuerungsplatine mithilfe von Software von Drittanbietern erforderlich ist. Dies kann für einen unerfahrenen Benutzer herausfordernd und einschüchternd sein und zu versehentlichen Änderungen oder einer Beschädigung der Firmware führen. Zweitens bietet das Duet 2 viele fortschrittliche Verbesserungen der Bewegungssteuerung, darunter (i) einen elektronischen 32-Bit-Controller, (ii) leistungsstarke Trinamic TMC2260-Schrittsteuerungen, (iii) verbesserte Bewegungssteuerung mit bis zu 256 × Mikroschritten für 5 Achsen, (iv ) hoher Motorstromausgang von 2,8 A zur Erzeugung höherer Leistung, (v) ein integrierter microSD-Kartenleser für Firmware-Speicherung und Dateiübertragung und (vi) Erweiterungskarten für Kompatibilität für 5 zusätzliche Achsen, Servocontroller, Extruderheizungen, bis zu 16 zusätzliche I/O-Anschlüsse und Unterstützung für einen Raspberry Pi-Einplatinencomputer. Schließlich ist die Online-Einrichtungs- und Support-Dokumentation für Duet 2 WiFi ausführlich, wird regelmäßig aktualisiert und durch ein aktives Benutzerforum unterstützt. Während wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Hardwareaspekte dieser Konvertierung und die grundlegende Einrichtung des Duet 2 WiFi bereitstellen, verweisen wir diejenigen, die zusätzliche Modifikationen vornehmen möchten, auf die offizielle Duet3D-Dokumentation. Zusammen bieten diese Funktionen eine hochpräzise Bewegungssteuerung und umfassende Erweiterbarkeit mit einer benutzerfreundlichen Weboberfläche, die eine schnelle Anpassung und eine verbesserte Leistung gegenüber Standard-Desktop-Kunststoffdruckern ermöglicht.

Nach der Konvertierung wurden die Bewegungsgrenzen der X-, Y- und Z-Achse gemessen, um das Bauvolumen des 3D-Biodruckers zu bestimmen. Der Verfahrweg auf der X-Achse beträgt 105 mm, der Verfahrweg auf der Y-Achse 150 mm und der Verfahrweg auf der Z-Achse 50 mm, was zu einem Gesamtbauvolumen von 787,5 cm3 führt (Abb. 3A). Bei einem schrittmotorgetriebenen Bewegungssystem wie diesem 3D-Biodrucker und den meisten kommerziellen 3D-Druckern ist die Kalibrierung der Schritte pro mm für jede der drei Achsen der wichtigste Steuerparameter, der sich auf die Leistung auswirkt. Diese Zahl bestimmt, wie viele Impulse oder Schritte an die Schrittmotoren gesendet werden müssen, die jede Achse antreiben, um sie jeweils genau einen Millimeter zu bewegen. Für die X- und Y-Achsen, die über einen Riemen angetrieben werden, lautet die Formel hierfür \(Schritte/mm=(Schritte/Umdrehung\mal Mikroschritte)/(Riementeilung\mal Riemenscheibenzähne)\). Für den Finder sind diese Parameter die Nennteilung des Antriebsriemens (2 mm), die Anzahl der Zähne in der Riemenscheibe des Motors (17 Zähne), die Anzahl der Schritte bei einer vollen Umdrehung des Motors (200 Schritte) und die Anzahl Anzahl der Mikroschritte, die das Duet 2 WiFi zwischen den Vollschritten interpoliert (eingestellt auf 64 Mikroschritte). In diesem Fall betragen die nominellen Schritte/mm für die X- und Y-Achse 376,5. Für die Z-Achse, die eine Leitspindel verwendet, lautet die Formel \(Schritte/mm=(Schritte/Umdrehung\mal Mikroschritte)/(Spindelsteigung\mal Spindelstarts)\). Der Sucher verwendet eine 4-Gang-Leitspindel mit 2 mm Steigung, sodass die Nennschritte/mm für 16 × Mikroschritt 400 Schritte/mm beträgt.

Messung und Korrektur des Druckerwegs. (A) Der X-Achsen-Verfahrweg beträgt 105 mm, der Y-Achsen-Verfahrweg beträgt 150 mm und der Z-Achsen-Verfahrweg beträgt 50 mm. (B) Der Bewegungsfehler für die X-Achse über ein 10-mm-Fenster vor der Korrektur (rot) und nach der Korrektur (blau). (C) Der Bewegungsfehler für die Y-Achse über ein 10-mm-Fenster vor der Korrektur (rot) und nach der Korrektur (blau). (D) Der Bewegungsfehler für die Z-Achse über ein 10-mm-Fenster vor der Korrektur (rot) und nach der Korrektur (blau).

Beim Vergleich der Leistung von 3D-Biodruckern sind mehrere wichtige Spezifikationen zu berücksichtigen, die sich direkt auf die Druckqualität beziehen. Die meisten thermoplastischen 3D-Drucker bieten Spezifikationen für die Auflösung, die als der kleinste Schritt definiert ist, den der Drucker in eine beliebige Richtung machen kann. Die gemeldeten Zahlen für den FlashForge Finder und mehrere beliebte im Handel erhältliche Biodrucker finden Sie in Tabelle 1. Weitere Spezifikationen im Zusammenhang mit dem Bewegungssystem sind der Positionsfehler, der als absolute Abweichung der aktuellen Position des Druckkopfs von der beabsichtigten Position definiert ist. und Wiederholbarkeit, die als maximale absolute Abweichung der gemessenen Position von der durchschnittlich gemessenen Position definiert ist, wenn versucht wird, diese Position mehrmals zu erreichen. Diese anspruchsvolleren Metriken fehlen im Bioprinting-Bereich weitgehend und können je nach Drucker je nach mechanischen Komponenten und Montagegenauigkeit variieren. Darüber hinaus handelt es sich bei der in den Bioprinter-Spezifikationen angegebenen Auflösung im Allgemeinen um Idealwerte, die auf den Nennabmessungen der Zahnräder, Riemenscheiben und Schrauben basieren, die zum Zusammenbau des Bewegungssystems verwendet werden. Keiner der zuvor genannten Hersteller liefert Messungen der tatsächlichen Auflösung, also des Fehlers über den gesamten Verfahrweg, oder der Wiederholbarkeit. Diese Messungen werden üblicherweise mit Ultra-High-End-Bewegungsplattformen wie denen von Aerotech und Physik Instrumente28,29 durchgeführt. Um die reale Leistung dieser kostengünstigen, auf 3D-Druckern basierenden Systeme zu ermitteln und anschließend zu optimieren, ist es notwendig, den Weg mit einem externen Werkzeug zu messen.

Um zu überprüfen, ob die nominellen Schritte/mm-Werte korrekt waren, haben wir den Positionsfehler unseres Systems entlang jeder Achse nahe der Bewegungsmitte mit einer Genauigkeit von 2 µm quantifiziert. Für die X-Achse gab es einen systematischen Unterlauf unter Verwendung der nominellen Schritte/mm (Abb. 3B, rote Kurve). Mithilfe des maximalen Fehlers bei 10 mm Verfahrweg haben wir die Anzahl der verpassten Schritte pro mm ermittelt und den Wert korrigiert. Mit diesen korrigierten Schritten/mm betrug der durchschnittliche Verfahrfehler über das 10-mm-Fenster 7,9 µm (Abb. 3B, blaue Kurve). . Für die Y-Achse kam es zu einem systematischen Unterlauf unter Verwendung der nominellen Schritte/mm (Abb. 3C, rote Kurve) und nach der Korrektur wurde dieser auf 29,1 µm reduziert (Abb. 3C, blaue Kurve). Schließlich kam es für die Z-Achse zu einem systematischen Unterlauf unter Verwendung der nominalen Schritte/mm (Abb. 3D, rote Kurve) und wurde nach der Korrektur auf 32,3 µm reduziert (Abb. 3D, blaue Kurve). Die Werte ermöglichen auch die Berechnung der unidirektionalen Wiederholgenauigkeit, also der Genauigkeit der Rückkehr zu einer bestimmten Position von nur einer Seite der Achse (z. B. von 0 bis 5 mm), und der bidirektionalen Wiederholgenauigkeit, also der Genauigkeit der Rückkehr zu einer bestimmten Position Position von beiden Seiten der Achse (z. B. von 0 bis 5 mm und von 10 bis 5 mm). Für die X-Achse betrug die unidirektionale Wiederholgenauigkeit 3,9 µm und die bidirektionale Wiederholgenauigkeit 16,4 µm. Für die Y-Achse betrug die unidirektionale Wiederholgenauigkeit 11,5 µm und die bidirektionale Wiederholgenauigkeit 63,9 µm. Für die Z-Achse betrug die unidirektionale Wiederholgenauigkeit 8,7 µm und die bidirektionale Wiederholgenauigkeit 38,7 µm. Zusammengenommen zeigen diese Messungen, dass der Verfahrweg unseres umgebauten Bioprinters mit der Kalibrierung einen maximalen Fehler von 35 µm und eine Wiederholbarkeit im schlimmsten Fall von 65 µm aufwies. Während vor der Kalibrierung ein linear zunehmender Positionsfehler auftrat, ist dieser Fehler nach der Kalibrierung deutlich verringert. Ohne diese Kalibrierung oder zumindest die Messung der Fehler wäre es unmöglich festzustellen, ob Fehler in gedruckten Konstrukten auf den Drucker selbst oder andere Faktoren zurückzuführen sind, die die Druckqualität beeinträchtigen.

Genauigkeit und Auflösung gedruckter Konstrukte werden für 3D-Biodrucker normalerweise nicht quantifiziert, da sie Biotinten nicht auf eine Weise drucken können, die den mechanischen Einschränkungen der Systeme nahe kommt. Dank der jüngsten Fortschritte bei eingebetteten Bioprinting-Techniken wie FRESH13 ist es nun jedoch möglich, Extrusions-Bioprinting mit Auflösungen von nahezu 20 µm durchzuführen. Um die Druckleistung des Biodruckers zu demonstrieren, haben wir daher ein Gerüstdesign mit quadratischem Gitter erstellt, das aus Filamentabständen von 1000 und 500 µm besteht (Abb. 4A), um die Genauigkeit zu messen, wenn FRESH aus einer Kollagen-Typ-I-Biotinte gedruckt wurde (Abb. 4B). Um den Gitterabstand zu messen, haben wir mithilfe der optischen Kohärenztomographie (OCT) ein volumetrisches 3D-Bild aufgenommen (Abb. 4C)30, das eine enge Übereinstimmung zwischen den entworfenen und den gemessenen Abmessungen zeigte (Abb. 4D). Darauf folgte ein komplexeres Design, das auf einem 3D-Scan eines erwachsenen menschlichen Ohrs basierte (Abb. 4E). Dieses Modell wurde mit Kollagen gedruckt (Abb. 4F). Um die Genauigkeit zu analysieren, haben wir mithilfe der OCT ein 3D-Volumenbild des gedruckten Ohrs aufgenommen (Abb. 4G, ergänzende Abb. S24)30. Die 3D-Rekonstruktion zeigt eine Wiederholung der Merkmale des Modells und die 3D-Messanalyse ergab eine Abweichung von – 29 ± 107 µm (Mittelwert ± STD) zwischen dem FRESH-gedruckten Ohr und dem ursprünglichen 3D-Modell (Abb. 4H)30. Zusammengenommen zeigen diese beiden Beispiele, dass der durchschnittliche Fehler und die Standardabweichung der gedruckten Gerüste innerhalb der mechanischen Grenzen des von uns gebauten Biodruckers liegen und mit kommerziellen Biodruckern vergleichbar sind31.

Drucken Sie maßgenaue Gitter und organische Formen. (A) Modell eines Gittergerüsts mit 500-µm- und 1000-µm-Gitter. (B) Foto des mit Kollagen Typ I gedruckten Gittergerüsts. (C) Ein OCT-Bild des Gittergerüstdrucks. (D) Analyse der Genauigkeit des gerasterten Gerüstdrucks (Mittelwert ± STD.; n = 11 Messungen für 1000 µm-Raster, n = 26 Messungen für 500 µm-Raster, p < 0,0001 [****] für 1000 µm im Vergleich zu 500 µm durch Student's zweiseitigen, ungepaarten t-Test). (E) Ein 3D-Modell eines Ohrs. (F) Ein Foto des mit Kollagen Typ I gedruckten Ohrs. (G) Ein volumetrisches OCT-Bild des gedruckten Ohrs. (H) Quantitative Messung des Ohrabdrucks anhand des ursprünglichen 3D-Modells.

Hier haben wir den Kunststoff-3D-Drucker FlashForge Finder in einen 3D-Bioprinter umgewandelt und eine detaillierte Anleitung für den Vorgang bereitgestellt. Obwohl mehrere Umrüstungen von Biodruckern veröffentlicht wurden und nützliche Erkenntnisse geliefert haben15,16,17,18,19,20, besteht weiterhin Bedarf an einer benutzerfreundlichen Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Umstellung unter Verwendung weithin verfügbarer Komponenten Es wurde validiert, dass es ein hohes Leistungsniveau bietet. Der FlashForge Finder ist kostengünstig (ca. 300 US-Dollar) und weltweit bei Online-Händlern erhältlich, sodass er für die Forschungsgemeinschaft allgemein zugänglich ist. Darüber hinaus verwenden wir eine gut unterstützte Open-Source-Bewegungssteuerungsplatine für 3D-Drucker, die Duet 2 WiFi von Duet3D. Alle für die Umrüstung erforderlichen Komponenten sind entweder 3D-gedruckt aus Kunststoff, z. B. PLA, oder weit verbreitete grundlegende Befestigungs-, Linearbewegungs- und Motorhardware. Die Gesamtkosten, einschließlich der Replistruder 4-Komponenten, betragen weniger als 900 US-Dollar. Darüber hinaus bietet die Schritt-für-Schritt-Anleitung (siehe Zusatzmaterial) zwar spezifische Anweisungen für den FlashForge Finder, die Anweisungen sind jedoch verallgemeinerbar und können zur Umwandlung einer Vielzahl anderer 3D-Drucker in Bioprinter verwendet werden. Beispielsweise haben wir Schlitten entwickelt, um den Replistruder an anderen Druckern wie dem MakerGear M2 und dem LulzBot Mini 2 zu montieren (Teildateien herunterladbar unter https://doi.org/10.5281/zenodo.7496012). Zusammengenommen machen diese Elemente unsere Konvertierung sowohl zu einer benutzerfreundlichen Einführung für Anfänger als auch zu einem Ausgangspunkt für fortgeschrittenere Konvertierungen und Anpassungen von 3D-Druckern.

Beim 3D-Bioprinting-Prozess ist es wichtig sicherzustellen, dass das zu druckende Objekt den Abmessungen und der Geometrie des eingegebenen 3D-CAD-Modells entspricht. Für den Spritzenpumpenextruder Replistruder 4 wurde diese Überprüfung in zuvor veröffentlichten Arbeiten14 durchgeführt. Für den hier gebauten 3D-Biodrucker führten Nominalwerte für Bewegungssteuerungsparameter zu einem maximalen Fehler über einen 10-mm-Verfahrbereich von ~ 100 µm oder ~ 1 % (Abb. 3B–D). Für viele Bioprinting-Anwendungen ist dies eine ausreichende Genauigkeit. Wir zeigen jedoch, dass durch eine weitere Kalibrierung des Druckers die Genauigkeit um das Dreifache auf ~ 33 µm verbessert werden kann (Abb. 3B–D). Wenn man bedenkt, dass die meisten Düsendurchmesser von Biodruckern zwischen 100 und 500 µm liegen, führt dies zu qualitativ hochwertigen Ergebnissen für ein breites Anwendungsspektrum12,13,30. Obwohl die Analyse des Bewegungssteuerungssystems wichtig ist, bietet sie keine vollständige Bewertung der Leistung des Biodruckers. Für eine vollständige Leistungsbewertung haben wir uns an den Tests für die subtraktive Hochleistungsbearbeitung orientiert, bei denen bearbeitete Teile gemessen werden, um die Genauigkeit nachzuweisen. Beim Bioprinting kann eine vergleichbare Beurteilung der Wiedergabetreue durch Messung der 3D-Bioprinting-Teile (also Konstrukte) durchgeführt werden. Diese Methodik ist relevanter als nur die XYZ-Verfahrauflösung des Druckers, da die Wiedergabetreue biogedruckter Teile auch von Material- und chemischen Wechselwirkungen abhängt, die während der Herstellung auftreten. Soweit uns bekannt ist, messen aktuelle Bioprinter-Hersteller nicht die Genauigkeit der gedruckten Teile (d. h. Konstrukte), die mit ihren Bioprintern hergestellt wurden, was einen direkten Vergleich mit unserem Open-Source-Bioprinter schwierig macht.

Bei unserer ersten Druckcharakterisierung, dem quadratischen Gittergerüst, stimmten die 1000- und 500-µm-Gitter gut mit ihren beabsichtigten Abmessungen überein und es wird angenommen, dass die leichten Abweichungen auf die Nachbearbeitung der 1000 µm langen Kollagenfilamente mit 90 µm Durchmesser zurückzuführen sind. In Übereinstimmung mit dieser Argumentation hatte das 500-µm-Raster, das sich nur dadurch unterschied, dass es häufigere Kontaktpunkte zwischen orthogonalen Filamenten aufwies, im Vergleich zum 1000-µm-Raster eine höhere Genauigkeit. Der zweite Druck, das Ohrgerüst, zeigte, dass der Bioprinter komplexere 3D-Formen erzeugen kann, und die quantitative Messanalyse bestätigte, dass die mit Kollagen-Bioink erzielte Wiedergabetreue unseren veröffentlichten Ergebnissen mit anderen FRESH 3D-Bioprintern ähnelte13,14,32. Weitere wichtige Eigenschaften von FRESH-gedruckten Kollagenkonstrukten, wie etwa zeitliche Stabilität und Biokompatibilität, wurden in unserer früheren Arbeit ausführlich beschrieben13,30,32. Diese Beispiele zeigen, dass der umgebaute 3D-Biodrucker sowohl präzise Bewegungen als auch einen hochauflösenden Druck der beabsichtigten Geometrie ermöglicht.

Ein wichtiger Aspekt von Open-Source-Hardware ist neben den geringeren Kosten die Möglichkeit, ihre Fähigkeiten für bestimmte Anwendungen zu ändern und zu erweitern. Für den zuvor veröffentlichten Spritzenpumpenextruder Replistruder 4 haben wir vollständige Druck- und Designdateien bereitgestellt, die in Standard-CAD-Software problemlos geändert werden können. Hier bauen wir darauf auf, indem wir komplette Druck- und Designdateien für den X-Achsen-Schlitten und verschiedene Probenhalter bereitstellen, unter anderem für 35-mm-Petrischalen und Multiwellplatten. Diese Dateien ermöglichen die Modifikation des Druckers für verschiedene Spritzentypen und -größen sowie für verschiedene Druckbehälter. Das Duet 2 WiFi ermöglicht auch erweiterte Funktionen, einschließlich Druckbett- und Spritzenheizungen und -kühlern sowie Sensoren, die mithilfe der fortschrittlichen G-Code-Implementierung gesteuert werden können. Zusätzliche Werkzeuge werden ebenfalls unterstützt, wie z. B. Extruder mit mehreren Spritzenpumpen, Laser, subtraktive Werkzeuge (z. B. Mühlen), UV-Lichtumschaltung, automatisierte Werkzeugumschaltung und G-Code-Makros. Zusammengenommen macht dieses breite Potenzial für Erweiterbarkeit und Modifikation unseren 3D-Bioprinter zu einer leistungsstarken Plattform für die Entwicklung fortschrittlicher 3D-Bioprinting-Anwendungen.

Schließlich ist der 3D-Biodrucker, den wir hier entwickelt haben, das Ergebnis einer mehrjährigen Entwicklung, in der wir mit Ingenieuren, Wissenschaftlern und Ärzten zusammengearbeitet und sie im Aufbau und der Nutzung dieser Systeme geschult haben. Es basiert auf dem „3D Bioprinting Open-Source Workshop“, den wir seit 2018 an der Carnegie Mellon University organisieren und in dem wir Auszubildende aus Forschungslaboren auf der ganzen Welt unterrichtet haben, darunter Australien, Kanada, Israel, Japan, Korea und die USA Vereinigte Staaten. Die hier beschriebene Konvertierung des FlashForge Finders in einen 3D-Bioprinter wurde für die Workshops 2021 und 2022 verwendet und diente als Grundlage für die mitgelieferte Schritt-für-Schritt-Konvertierungsanleitung (siehe Begleitmaterial). Wir hoffen, durch diese Veröffentlichung die Zahl der Forscher zu erhöhen, die von dieser Anstrengung lernen und davon profitieren können. Darüber hinaus hoffen wir, dass dieser 3D-Biodrucker als Beispiel dafür dienen kann, welche Auswirkungen offene Wissenschaft auf die Beschleunigung von Forschungsfortschritten haben kann und wie wichtig es ist, möglichst vielen Forschern kostengünstige und leistungsstarke wissenschaftliche Werkzeuge in die Hände und Labore zu geben möglich.

Um den Weg des Druckers mit hoher Präzision zu messen, verwendeten wir einen Mitutoyo Absolute Digimatic Indicator (Mitutoyo, Japan, 542-500B) mit einer Genauigkeit von ± 2 µm, der zur Ausrichtung an den Achsen des Druckers auf einer Noga-Magnetbasis montiert war. Um eine bestimmte Achse zu messen, wurde das Messgerät parallel zur Achse ausgerichtet und dann auf den vollen Verfahrweg gefahren und dann mithilfe der Druckersteuerung der Duet Web Control auf 100 µm weniger als den vollen Verfahrweg zurückgefahren (um sicherzustellen, dass jegliches Spiel beim anfänglichen Verfahrweg berücksichtigt wurde). hoch). Anschließend wurde die Achse mithilfe der Duet Web Control in nominellen 1-mm-Schritten vom Messgerät wegbewegt. Die vom Messgerät abgelesene tatsächliche Position wurde aufgezeichnet. Dieser Vorgang wurde wiederholt, bis ein Nennweg von 10 mm erreicht war, dann wurde der Vorgang umgekehrt, bis die Nennposition wieder 0 war. Die Nullposition wurde zurückgesetzt und der Vorgang noch zweimal wiederholt. Aus diesen Messungen wurde der Fehler als absolute Differenz zwischen der Sollposition und der gemessenen Position definiert. Die unidirektionale Wiederholbarkeit war der Fehler für den zweiten und dritten Versuch bei der Rückkehr zu jeder Position in jede Richtung im Vergleich zum ersten Versuch. Die bidirektionale Wiederholbarkeit war der absolute Wert der Differenz zwischen den tatsächlichen Positionsmessungen an den gepaarten Sollpositionen (Entfernung und dann Rückkehr zu Null).

Um die Achsen zu kalibrieren, werden zunächst die Nennschritte/mm für jede Achse in die Duet WiFi 2-Konfigurationsdatei eingegeben. Der maximale Fehler bei 10 mm Weg aus den drei Versuchen wurde bestimmt und dann wurden die Schritte/mm für jede Achse proportional zum Fehler skaliert. Das heißt, wenn die Nennschritte/mm 376,5 wären und es einen Gesamtweg von 9,887 mm gäbe, wäre die Korrektur (10 mm)/(9,887 mm) × (376,5 Schritte/mm) = 380,8 Schritte/mm. Dieser Vorgang wurde dann für die anderen beiden Achsen wiederholt. Nach der Kalibrierung kann der Messvorgang wiederholt werden, um die Genauigkeit zu überprüfen.

Alle 3D-CAD-Modelle für gedruckte Kunststoffkomponenten der FlashForge Finder-Konvertierung und des Replistruder 4 wurden mit Autodesk Inventor 2020 (Autodesk) erstellt. Die CAD-Dateien und STL-Dateien für den Replistruder 4 können von Zenodo unter https://doi.org/10.5281/zenodo.4119127 heruntergeladen werden. CAD- und STL-Dateien können von Zenodo unter https://doi.org/10.5281/zenodo.7496012 für die FlashForge Finder 3D-Bioprinter-Konvertierung sowie Dateien für die Konvertierung des MakerGear M2 und Lulzbot Mini 2 heruntergeladen werden. Das mit gedruckte Gittermodell Der Rasterabstand von 500 und 1000 µm wurde mit Autodesk Inventor 2020 generiert. Das Ohrmodell wurde von http://www.cgtrader.com/ gekauft und vom Verkäufer Sakura-pms generiert.

Der G-Code für gedruckte Kunststoffkomponenten der Flashforge Finder-Konvertierung und des Replistruder 4 wurde mit PrusaSlicer (Prusa) generiert. Alle Modelle wurden aus PLA-Kunststoff mit 60 % Füllung ohne Stützmaterial gedruckt. Der G-Code für das Ohrmodell wurde mit Cura 4.3.0 (Ultimaker) generiert. Der G-Code für das Gittermodell wurde mit Simplify 3D (Simplify3D) generiert.

Das Gelatine-Mikropartikel-Trägerbad FRESH v2.0 wurde mithilfe einer komplexen Koazervationsmethode zur Herstellung von Gelatine-Mikropartikeln basierend auf veröffentlichten Methoden13 erzeugt. Kurz gesagt, 2,0 % (Gew./Vol.) Gelatine Typ B (Fisher Chemical), 0,25 % (Gew./Vol.) Pluronic® F-127 (Sigma-Aldrich) und 0,1 % (Gew./Vol.) Gummi Arabicum (Sigma-Aldrich). in einem 1-L-Becherglas bei 45 °C in einer 50 %igen (v/v) Ethanollösung gelöst und durch Zugabe von 1 M Salzsäure auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt. Dann wurde ein Überkopfrührer (IKA, Modell RW20) verwendet, um das Mischen aufrechtzuerhalten, während das Becherglas mit Parafilm verschlossen wurde, um die Verdunstung zu minimieren, und die Mischung unter Rühren über Nacht auf Raumtemperatur abgekühlt wurde. Die resultierende Lösung wurde in 250-ml-Behälter überführt und 2 Minuten lang bei 300 g zentrifugiert, um die Gelatine-Mikropartikel zu verdichten. Der Überstand wurde verworfen und die Gelatine-Mikropartikel wurden in einer Lösung von 50 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) (Corning) bei pH 7,4 resuspendiert. Um das Ethanol und Pluronic® F-127 zu entfernen, wurde das Gelatine-Mikropartikel-Trägerbad dann dreimal mit derselben HEPES-Lösung gewaschen und bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert. Vor dem Drucken wurde der unverdichtete Träger 3 Minuten lang bei 1000 g zentrifugiert und dann mit 50 mM HEPES gewaschen. Nach dem letzten Waschen wurde das Gelatine-Mikropartikel-Trägerbad in 50 mM HEPES suspendiert, 15 Minuten lang in einer Vakuumkammer entgast und je nach gewünschtem Verdichtungsgrad 5 Minuten lang bei 1900–2100 g zentrifugiert. Schließlich wurde der Überstand entfernt und das Gelatine-Mikropartikel-Trägerbad in einen Druckbehälter überführt.

Bioink aus reinem Kollagen Typ I (LifeInk 200, Advanced Biomatrix). wurde wie zuvor beschrieben13 hergestellt. Kurz gesagt, der Vorrat von 35 mg/ml LifeInk wurde mit Spritzen im Verhältnis 2:1 mit 0,24 M Essigsäure gemischt, um einen angesäuerten Kollagen-Bioink mit 23,33 mg/ml herzustellen. Der Bioink wurde dann 5 Minuten lang bei 3000 g zentrifugiert, um Blasen zu entfernen. Zum Drucken wurde die Kollagen-Biotinte in eine gasdichte 2,5-ml-Spritze (Hamilton Company) überführt.

Fotos von gedruckten Konstrukten wurden mit einem Laowa 24-mm-Sondenobjektiv (Venus Optics) aufgenommen, das an einer spiegellosen Sony ILCE7M-Digitalkamera montiert war. OCT-3D-Bildstapel wurden mit einem Thorlabs Vega 1300 nm OCT-System mit dem OCT-LK4-Objektiv (Thorlabs)30 erfasst. OCT-Bilder wurden zur Visualisierung mit Fiji (ImageJ, NIH) mit Rauschunterdrückung, Medianfilterung und Stapelhistogrammausgleich erstellt. Die Bildstapel wurden dann als TIF-Dateien exportiert und mit 3D Slicer33 geöffnet. Die Volumenrenderingfunktionen wurden dann verwendet, um 3D-Ansichten des volumetrischen OCT-Bildes zu erstellen.

Die Messung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt30. Kurz gesagt, wurde mittels OCT ein 3D-Volumenbild des Ohrkonstrukts aufgenommen. Das Bild wurde dann bereinigt und segmentiert, um mit 3D Slicer33 eine 3D-Rekonstruktion zu erstellen. Die 3D-Rekonstruktion und das ursprüngliche 3D-Modell wurden dann in CloudCompare (www.cloudcompare.com)34 importiert. In CloudCompare wurden die beiden 3D-Objekte ausgerichtet und registriert und anschließend wurde die Rekonstruktion mit dem ursprünglichen 3D-Modell abgeglichen, um Fehler zu ermitteln. Die Fehler wurden als Mittelwert ± STD berechnet.

Statistische und grafische Analysen wurden mit Prism 9 (GraphPad) und Excel (Microsoft) durchgeführt. Statistische Tests wurden basierend auf der experimentellen Stichprobengröße, der Verteilung und den Datenanforderungen ausgewählt. Die Analyse des 1000- und 500-µm-Rasterdrucks wurde mit Fiji (Image J NIH) und MATLAB (Mathworks) durchgeführt. Für den Vergleich der beiden Gittergrößen wurde ein zweiseitiger ungepaarter t-Test nach Student verwendet.

Die CAD-Dateien und STL-Dateien für den Replistruder 4 können von Zenodo unter https://doi.org/10.5281/zenodo.4119127 heruntergeladen werden. CAD- und STL-Dateien können von Zenodo unter https://doi.org/10.5281/zenodo.7496012 für die FlashForge Finder-Konvertierung in den 3D-Bioprinter heruntergeladen werden. Alle Rohdaten, die nicht im Haupt- und Ergänzungstext enthalten sind, sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Wir möchten Brian Coffin und Andrew Hudson für die Durchsicht der ergänzenden Materialien danken. Wir möchten auch den Teilnehmern des 3D-Biodruck-Open-Source-Workshops 2021 und 2022 der Regenerative Biomaterials and Therapeutics Group für reale Tests des Konvertierungsprozesses danken. Darüber hinaus möchten wir dem Thingiverse-Benutzer (www.thingiverse.com) ChrisGilleti danken, der das Originalmodell für das bei diesem Umbau verwendete Duet2 WiFi-Gehäuse entworfen hat (Ding 3721923).

Diese Arbeit wurde von der Food & Drug Administration (R01FD006582) und dem National Heart, Lung, And Blood Institute der National Institutes of Health (1F30HL154728, K99HL155777) unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Joshua W. Tashman und Daniel J. Shiwarski.

Abteilung für Biomedizintechnik, Carnegie Mellon University, Pittsburgh, PA, 15213, USA

Joshua W. Tashman, Daniel J. Shiwarski und Adam W. Feinberg

Abteilung für Materialwissenschaft und Werkstofftechnik, Carnegie Mellon University, Pittsburgh, PA, 15213, USA

Adam W. Feinberg

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Alle Autoren konzipierten die Experimente und trugen zur wissenschaftlichen Planung und Diskussion bei. JWT und DJS haben endgültige Zahlen und Texte vorbereitet. JWT hat den Konvertierungsleitfaden geschrieben. JWT führte Bioprinting und OCT-Bildgebung durch. JWT und DJS führten Bildanalysen in Fidschi und MATLAB durch. JWT, DJS und AWF haben den Artikel geschrieben und die Daten interpretiert.

Korrespondenz mit Adam W. Feinberg.

AWF ist an FluidForm Inc. beteiligt, einem Startup-Unternehmen, das FRESH 3D-Druck vermarktet. Der FRESH 3D-Druck ist Gegenstand des Patentschutzes, einschließlich des US-Patents 10.150.258 und des vorläufigen Patents Nr. 63/082621. Bei keinem anderen Autor bestehen Interessenkonflikte.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Tashman, JW, Shiwarski, DJ & Feinberg, AW Entwicklung eines leistungsstarken Open-Source-3D-Biodruckers. Sci Rep 12, 22652 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26809-4

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Eingegangen: 11. September 2022

Angenommen: 20. Dezember 2022

Veröffentlicht: 31. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26809-4

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