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Nature Biomedical Engineering (2023)Diesen Artikel zitieren

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Krebsimpfstoffe müssen mehrere Immunzelltypen aktivieren, um gegen aggressive Tumore wirksam zu sein. Hier berichten wir über den Einfluss der strukturellen Präsentation zweier antigener Peptide auf Immunantworten auf transkriptomischer, zellulärer und organisatorischer Ebene. Wir haben Nanopartikel aus sphärischer Nukleinsäure (SNA) verwendet, um zu untersuchen, wie sich die räumliche Verteilung und Platzierung zweier Antigenklassen auf die Antigenverarbeitung, die Zytokinproduktion und die Gedächtnisinduktion auswirkt. Im Vergleich zu Einzelantigen-SNAs löste eine einzelne Dualantigen-SNA eine 30-prozentige Steigerung der Antigen-spezifischen T-Zell-Aktivierung und eine zweifache Steigerung der T-Zell-Proliferation aus. Die Platzierung von Antigenen in Dual-Antigen-SNAs veränderte die Genexpression von T-Zellen und das Tumorwachstum. Insbesondere erhöhten Dual-Antigen-SNAs, die Antigene einkapseln, die auf T-Helferzellen abzielen, und mit extern konjugierten Antigenen, die auf zytotoxische T-Zellen abzielen, die genetischen Antitumor-Signalwege und bremsten Lymphomtumoren bei Mäusen aus. Darüber hinaus unterdrückte eine spezifische Antigenanordnung in Dual-Antigen-SNAs in Kombination mit dem Checkpoint-Inhibitor Anti-Programmed-Cell-Death Protein-1 in einem Mausmodell des Melanoms das Tumorwachstum und erhöhte die Menge an zirkulierenden Gedächtnis-T-Zellen. Das strukturelle Design von Multiantigen-Impfstoffen hat erheblichen Einfluss auf ihre Wirksamkeit.

Die Impfung ist eine attraktive Strategie gegen Krebserkrankungen, die zielgerichtete tumorassoziierte Antigene und Neoantigene exprimieren. Für Melanome wurden zunehmend Anstrengungen unternommen, Impfstoffe zu entwickeln, die auf identifizierte tumorassoziierte Proteine ​​(z. B. gp100, MAGE-A3, MART-1 und NY-ESO-1) abzielen1,2,3,4. Obwohl diese Impfstoffe einige Vorteile mit sich bringen (z. B. die Erhöhung aktivierter melanomspezifischer T-Zellen), sind viele jedoch darauf ausgelegt, in erster Linie zytotoxische T-Zellen zu aktivieren. Tumoren können eine beträchtliche Heterogenität und eine hohe Mutationslast aufweisen5,6, die es leicht ermöglichen, der Immunüberwachung zu entgehen7. Daher sind Impfstoffe, die hauptsächlich auf der Aktivität zytotoxischer T-Zellen beruhen, unzureichend und erfordern Impfstoffe, die Antigene enthalten, die auf mehrere Immunzelltypen abzielen, um eine verstärkte Tumorremission zu induzieren.

Gängige Ansätze zur Auslösung einer vielschichtigen Immunantwort umfassen die Verabreichung „langer Peptide“, deren Sequenz mehrere Epitope abdeckt, um sowohl zytotoxische als auch T-Helferzellen zu aktivieren, oder von mehreren „minimalen“ Peptidantigenen, die jeweils nur für T-Zell-Unterklassen gelten8,9, 10,11. Bei vielen dieser laufenden Bemühungen handelt es sich jedoch um Pools von Peptiden, mit oder ohne Adjuvans, die als Mischung in Kochsalzlösung verabreicht werden. Kürzlich haben einfache Änderungen an der Abgabe von Impfstoffkomponenten mithilfe grundlegender chemischer Verknüpfungen12 oder Nanotechnologie13,14,15,16 das Potenzial der Strukturierung von Impfstoffen zur Verbesserung der Wirksamkeit gezeigt. Dieses als „rationale Vakzinologie“ bezeichnete Konzept bietet einen Weg zur strukturellen Optimierung der Platzierung von Antigenen, die auf mehrere Immunzelltypen abzielen, in einem Impfstoff für eine breite Antitumorimmunität.

In dieser Arbeit erforschen wir den Bereich der Impfstoffentwicklung, der mehrere zellgerichtete Antigene umfasst. Durch den Einsatz struktureller Veränderungen bei der Antigenplatzierung klären wir die Auswirkungen der resultierenden Immunantwort auf und nutzen sie, um den Erfolg der Translationsbemühungen voranzutreiben. Antigene nutzen aktivierte zytotoxische (CD8+) T-Zellen, um Tumore effektiv abzutöten, sowie Helfer-T-Zellen (CD4+), um Immuninteraktionen für eine langanhaltende Tumorabstoßung zu synergieren17,18. CD4+-T-Zellen behalten die tumorgesteuerte CD8+-Funktionalität bei, indem sie sie an die Tumorstelle rekrutieren und ihre Proliferation und Effektorfunktionen verbessern19,20,21,22,23. Daher berücksichtigen die Impfstoffe in dieser Arbeit die präzise strukturelle Platzierung sowohl der durch den Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-I eingeschränkten als auch der MHC-II-beschränkten Antigenziele (CD8+-aktivierend bzw. CD4+-aktivierend), um das Immunsystem am effektivsten vorzubereiten .

Hier verwenden wir die Plattform für sphärische Nukleinsäuren (SNA), um die Wirkung nanoskaliger Strukturen auf immunologische Prozesse mit mehreren Antigenen aufzuklären. Die SNA besteht aus einem Nanopartikelkern (z. B. einem Liposom) mit einer dichten und radial angeordneten Oberfläche aus Oligonukleotiden. SNAs sind aufgrund ihrer Biokompatibilität24, der Fähigkeit, schnell in großen Mengen in Zellen einzudringen25,26, ihrer starken Immunaktivierung bei Verwendung der Toll-like-Rezeptor-9 (TLR9)-Agonisten-DNA als Hülle27 und ihrer Modularität leistungsstarke Werkzeuge zur Erforschung dieser komplexen Beziehungen. Dies ermöglicht die definierte nanoskalige Platzierung von Komponenten mithilfe bekannter Chemie28,29,30. In dieser Arbeit zeigen wir, wie die Struktur von SNA-Impfstoffen, die mehrere gegen Immunzellen gerichtete Peptidantigene tragen, die Immunaktivierung stark beeinflusst. Eine Änderung der Position des Antigentyps innerhalb der SNA verändert die Verarbeitung dendritischer Zellen, reguliert die Immunzellwege auf Transkriptomebene hoch, steigert die Produktion und Sekretion von Zytokinen und Gedächtnismarkern auf zellulärer Ebene und verlangsamt das Tumorwachstum auf Organismusebene. Zusammengenommen definieren diese Änderungen die Wirksamkeit des Impfstoffs gegen ein aggressives B16-F10-Melanom-Tumormodell und verdeutlichen vor allem Designeinblicke in Bezug auf die Platzierung mehrerer Peptidantigene, die auf andere Therapeutika übertragen und deren Entwicklung gesteuert werden können.

Wir wollten die optimalen Antigenverarbeitungsbedingungen für Multiantigen-SNA-Impfstoffe ermitteln, um robuste zytotoxische und Helfer-T-Zell-Reaktionen zu erzeugen. Insbesondere untersuchten wir, wie die Abgabe von Peptiden für zwei Antigenklassen (MHC-I-beschränkt und MHC-II-beschränkt) an dendritische Zellen (DCs) die Verarbeitung in vitro verändern würde. DCs sind wichtige professionelle Antigen-präsentierende Zellen, die Signale für ein effektives T-Zell-Priming induzieren. Frühere Arbeiten haben das Potenzial gezeigt, die DC-Aktivierung durch die gleichzeitige Abgabe sowohl von zytotoxischen Antigenen als auch von Helferantigenen zu verbessern31,32, aber keines verfügte über ein System, das in der Lage wäre, die beste Art und Weise zu verstehen, solche Antigene zu präsentieren. Wir stellten die Hypothese auf, dass die gleichzeitige Abgabe beider Antigenklassen auf demselben Nanopartikel, im Gegensatz zur Abgabe auf verschiedenen Nanopartikeln, die Aktivierung beider T-Zelltypen steigert und dass die strukturelle Lage der Antigene die Wirksamkeit des Impfstoffs deutlich beeinflusst.

Um diese Hypothese zu testen, haben wir Dual-Antigen-SNA-Impfstoffe (DA-SNAs) entworfen und synthetisiert, die sowohl MHC-I-beschränkte als auch MHC-II-beschränkte Antigene an verschiedenen nanoskaligen Stellen enthielten (bezeichnet als DA-SNA 1 und DA-SNA 2). basierend auf der Platzierung jedes Antigens; Abb. 1a). Aufgrund der Modularität von SNAs gibt es innerhalb des SNA-Konstrukts mehrere verschiedene Stellen, an denen Antigene platziert werden können. Für diese Arbeit wurden Verkapselungs- und Hybridisierungsanordnungen für die Antigenplatzierung ausgewählt und miteinander verglichen. Um zu beurteilen, wie sich die Verteilung von Antigenen und die Abgabe auf verschiedenen Nanopartikeln auf die Immunaktivierung auswirken, wurden Formulierungen synthetisiert, die zwei einzelne SNAs enthielten, die jeweils nur eine Antigenklasse an derselben Position wie im DA-SNA-Impfstoff aufwiesen (ergänzende Abbildung 1). Die Formulierungen wurden für die einzelnen SNAs, die ein einzelnes Antigen liefern, als „getrennt“ und für die DA-SNA mit zwei Antigenen als „kombiniert“ bezeichnet.

a, Dual-Antigen-SNA-Impfstoffe (DA-SNA), die synthetisiert wurden, um die Platzierung von MHC-I-beschränkten und MHC-II-beschränkten Antigenen innerhalb derselben Nanopartikelstruktur zu verändern. b, Die Expression (gemessen durch MFI) der co-stimulierenden Marker CD80 (links) und CD86 (rechts) auf CD11c+ DCs basierend auf der Abgabe der beiden Antigenklassen entweder auf separaten Nanopartikeln (gestrichelt, getrennt) oder einer einzelnen DA-SNA ( massiv, kombiniert). c, CD8+ T-Zellen, die für das OVA1-Antigen spezifisch sind (links) oder CD4+ T-Zellen, die für das OVA2-Antigen spezifisch sind (rechts), gezüchtet aus einer Co-Kultur von behandlungsgepulsten DCs mit naiven Milz-T-Zellen. d, MFI des CD69-Aktivierungsmarkersignals innerhalb der Population antigenspezifischer CD8+- (links) oder CD4+-T-Zellen (rechts). e, Faltungsänderung in der T-Zell-Proliferation von OT1-Splenozyten, die für das OVA1-Antigen spezifisch sind, nach Co-Kultur mit behandlungsgepulsten DCs. Für alle Panels wird der Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt, zusammen mit der statistischen Signifikanz zwischen relevanten Vergleichen. Die Signifikanz wurde mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Sidak berechnet, mit n = 3–4 Wiederholungen pro Gruppe. NS, nicht signifikant.

Zur Synthese von DA-SNAs wurde ein Peptid aus einer Antigenklasse während ihrer Bildung in 50 nm große 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC)-Liposomen eingekapselt (Ergänzende Abbildungen 2 und 3). Parallel dazu wurde das Peptid der anderen Antigenklasse unter Verwendung einer Disulfidbindungsbildung an einen Strang konjugiert, der zur CpG-Motiv-Adjuvans-DNA-Hülle („CpG-Komplement“) der SNA komplementär war (ergänzende Abbildung 4). In dieser Arbeit verwendete DNA- und Peptidsequenzen sind in den Ergänzungstabellen 1 und 2 zu finden. Ein hybridisierter Duplex wurde durch langsames Abkühlen des CpG-Komplements mit einem angehängten Antigen an einen komplementären 3'-Cholesterin-terminierten CpG-Strang gebildet. Der Cholesterinanteil verankert den Duplex an der Oberfläche des Liposoms. Es wurde zuvor gezeigt, dass diese beiden Stränge bei Temperaturen unter ~56 °C effektiv duplizieren33,34. Dieses hybridisierte Produkt wurde den Liposomen zugesetzt, um eine äquimolare Menge jedes Antigens zu erhalten. Die Liposomenoberfläche wurde mit nicht-zielgerichteter T20-DNA, die kein Antigen enthielt, aufgefüllt, um insgesamt 75 DNA-Stränge pro Liposom zu erhalten, was einer Dichte von 1,6 pmol cm−2 entspricht, bei der mit SNAs verbundene Eigenschaften beobachtet werden, die sie in der Biologie nützlich machen16. SNAs, die entweder ein einzelnes eingekapseltes Antigen oder ein einzelnes hybridisiertes Antigen (die „separaten“ Formulierungen) enthalten, wurden nach früheren Protokollen synthetisiert16. Die SNA-Bildung wurde mittels dynamischer Lichtstreuung bestätigt (ergänzende Abbildung 5) und die Stabilität der Nanostrukturen blieb über 45 Tage erhalten (ergänzende Abbildung 6).

Sobald diese verschiedenen Strukturen synthetisiert waren, wurde ihre Fähigkeit, DCs zu primieren, mithilfe von MHC-I-beschränkten und MHC-II-beschränkten Modellantigenen von Ovalbumin (OVA), bekannt als OVA1 bzw. OVA2, bewertet. Die Aktivierung von DC-Signalen und die Fähigkeit, T-Zellen zu stimulieren, wurden mithilfe von DCs aus murinem Knochenmark (BMDCs) und Antigenen charakterisiert, die als zwei separate SNA-Strukturen im Vergleich zum kombinierten DA-SNA-Impfstoff verabreicht wurden. Eine Inkubation von BMDCs über Nacht mit den unterschiedlichen strukturellen Anordnungen des Impfstoffs zeigte, dass sich der Prozentsatz der CD11c+ DCs, die die angeborenen Kostimulationsmarker CD86 und CD80 exprimierten, nicht signifikant änderte (ergänzende Abbildung 7). Dies ist wahrscheinlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass eine längere Inkubation zu äquivalenten Mengen an Adjuvansabgabe zwischen den kombinierten und getrennten Formulierungen führen kann, und weist darauf hin, dass die Hybridisierung an CpG die TLR9-Aktivierung nicht beeinträchtigt. Um die Unterschiede zu maximieren und den Einfluss der frühen Kinetik auf die immunstimulierende Aktivität und die Expression der kostimulatorischen Marker zu bewerten, haben wir DCs 30 Minuten lang mit den verschiedenen Strukturformulierungen gepulst und die Medien ausgetauscht, bevor wir den DCs Zeit gegeben haben, kostimulatorische Signale auszudrücken. Die Ergebnisse (Abb. 1b) veranschaulichen, dass die Anordnung von Antigenen mit hybridisiertem OVA1 und eingekapseltem OVA2 entweder in separaten Nanopartikeln oder einem einzelnen DA-SNA-Konstrukt zu einer signifikanten Expression von CD80 und CD86 führt. Bei der Analyse einer Reihe von Dosen kommt es bei Verwendung höherer Konzentrationen zu einer erhöhten CD80- und CD86-Expression, und dies ist nicht auf eine bevorzugte Wechselwirkung von MHC-I mit Peptid zurückzuführen, die zu einer verstärkten Internalisierung führen könnte. Dieser Trend zeigt sich auch, wenn auch in geringerem Ausmaß, bei der Verwendung von SNAs, die einen anderen Satz von Peptiden enthalten (Extended Data Abb. 1). Die Präsentation von Antigenen gegenüber naiven Milz-T-Zellen zur Bildung antigenspezifischer T-Zellen, ein Indikator für die Fähigkeit des Immunsystems, Tumorantigene zu erkennen35, wurde durch die Art und Weise, wie die Antigene angeordnet waren, nicht beeinflusst; Naive T-Zellen konnten klonal zu OVA1- und OVA2-spezifischen T-Zellen expandieren (Abb. 1c; Gating-Strategie in ergänzender Abb. 8). Tatsächlich waren etwa 0,6–0,7 % der lebenden CD19−-Population doppelt positiv für das OVA1-H-2kb-Dimer und den CD8+-Marker. Ähnliche Trends wurden für die OVA2-spezifische T-Zelldifferenzierung beobachtet, wobei etwa 0,9–1,1 % doppelt positive Marker für das OVA2-H-2-Iad-Tetramer und den CD4+-Antikörper enthielten. Nur die DA-SNA-Strukturen und nicht die separaten Formulierungen waren in der Lage, die Menge an Antigen-spezifischen T-Zellen signifikant über die T-Zell-Kontrollbasislinie zu erhöhen; Dies legt nahe, dass die kombinierte Abgabe beider Antigene an DCs zu einer stärkeren T-Zell-Differenzierung führt. Dies wird deutlicher, wenn man die Expression des frühen Aktivierungsmarkers CD69 in beiden antigenspezifischen T-Zellpopulationen beurteilt. Eine erhöhte Menge an CD69-Signal (gemessen durch die mittlere Fluoreszenzintensität, MFI) ist vorhanden, wenn die Antigene kombiniert als ein DA-SNA abgegeben werden, wobei die DA-SNA 2-Struktur alle getesteten Gruppen übertrifft (Abb. 1d). Darüber hinaus führt die Abgabe von Antigenen in DA-SNA-Strukturen unabhängig von der Antigenplatzierung zu einem zweifachen Anstieg der T-Zell-Proliferation, einem wichtigen Schritt bei Antitumorreaktionen, wobei OT1-Splenozyten verwendet werden, die für das OVA1-Antigen spezifisch sind (Abb. 1e).

Auf der Grundlage dieser vielversprechenden In-vitro-Ergebnisse unter Verwendung von DA-SNAs haben wir bewertet, wie sich die Anordnung der abgegebenen Antigene auf die In-vivo-Immunantworten auswirkt. C57BL/6-Mäuse wurden immunisiert, um herauszufinden, wie die Formulierung von Antigenen auf separaten oder gleichen Nanostrukturen und wie sich die unterschiedliche Platzierung von MHC-I-beschränkten und MHC-II-beschränkten Antigenen in DA-SNA-Impfstoffen auf die Immunaktivierung auswirkt. Mäuse erhielten insgesamt drei Injektionen (6 nmol pro DNA und jedes Peptid; Abb. 2a und erweiterte Daten Abb. 2). Am 35. Tag wurden Splenozyten gesammelt, um erhöhte spezifische Immunantworten gegenüber beiden Peptidantigenen zu beurteilen. Nach dem 5-wöchigen Zeitraum waren die CD8+-Spiegel bei der DA-SNA 2-Immunisierung signifikant erhöht und erreichten etwa 35 % der Milzpopulation im Vergleich zu einer einfachen Mischung, die sowohl Peptidantigene als auch Adjuvans-DNA (als „Beimischung“ bezeichnet) enthielt, DA-SNA 1 und die separaten Äquivalente beider DA-SNAs wurden verwendet (Abb. 2b). Die CD4+-Spiegel veränderten sich nur signifikant, wenn Mäuse mit dem separaten Äquivalent von DA-SNA 1 behandelt wurden. Andere Behandlungsgruppen verringerten den Spiegel an CD4+-Milz-T-Zellen, wobei die DA-SNA 2-Gruppe mit ~11,4 % der Milzzellen den niedrigsten Wert aufwies Bevölkerung (Abb. 2b). DA-SNA 2 steigerte die Produktion eines wichtigen entzündungsfördernden Zytokins, IFN-γ, sowie des Degranulationsmarkers CD107a nach ex vivo-Restimulation mit OVA1-Peptid am deutlichsten. Die DA-SNA 2-Immunisierung erzeugte auch den größten Prozentsatz an polyfunktionellen Milz-CD8+-T-Zellen (~15 %, Abb. 2c, Gating-Strategie finden Sie in der ergänzenden Abb. 9). Darüber hinaus korrelierte dies mit einem Anstieg des Prozentsatzes der Effektor-Gedächtnis-CD8+-T-Zellen (CD44+CD62L−, ~54 %) (Abb. 2d, links). Die Mengen an proinflammatorischen Markern, die in CD8+ T-Zellen produziert werden, und die Polyfunktionalität der Population waren für die kombinierte DA-SNA 2-Struktur im Vergleich zu ihrem separaten Gegenstück signifikant erhöht (Abb. 2c). Die Ex-vivo-Stimulation von CD4+-T-Zellen mit dem OVA2-Peptid zeigte insgesamt einen Anstieg derselben Parameter sowohl für DA-SNAs als auch für die einzelnen Formulierungen im Vergleich zur Admix-Behandlung, was die Bedeutung der kombinierten Abgabe von Antigen und Adjuvans an eine Immunzelle weiter unterstreicht. Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen der DA-SNA 1-Struktur und ihrem separaten Äquivalent beobachtet. Diese beiden Konstrukte induzierten die höchsten Konzentrationen dieser proinflammatorischen Marker in CD4+-T-Zellen, obwohl zwischen den beiden DA-SNAs kein statistisch signifikanter Rückgang beobachtet wurde (Abb. 2c). Darüber hinaus wurde der größte Anstieg bei OVA1-spezifischen CD8+ T-Zellen für DA-SNA 2 beobachtet, etwa dreifach höher als sein separates Äquivalent (Abb. 2e). Letztendlich führte der Beitrag der kombinierten Abgabe beider Antigentypen in den DA-SNA-Strukturen zu einer stärkeren IFN-γ-Sekretion, gemessen durch einen Enzyme-Linked Immun Absorbing Spot (ELISpot)-Assay. Die Konzentrationen an fleckbildenden Zellen (SFCs) bei ex vivo-Stimulation mit dem MHC-I-beschränkten OVA1-Antigen waren mit DA-SNA 2 am höchsten, und DA-SNA 2 erzeugte 2,3-fach höhere SFCs als sein separates Gegenstück entweder auf MHC-I oder MHC-II-Antigen (OVA2) Ex-vivo-Stimulation (Abb. 2f). Für beide DA-SNA-Strukturen wurde im Vergleich zur Beimischung ein Anstieg der SFCs beobachtet; Die größte Steigerung insgesamt wurde für DA-SNA 2 beobachtet. Splenozyten, die durch DA-SNA 2-Immunisierung gezüchtet wurden, führten zu etwa 2,2-fach bzw. etwa 1,7-fach mehr SFCs als DA-SNA 1-Immunisierung, wenn sie ex vivo entweder mit OVA1 bzw. OVA2 stimuliert wurden Dies demonstriert die Wirksamkeit dieser Anordnung von Antigenen auf einer DA-SNA, um ex vivo auf MHC-I-beschränkte oder MHC-II-beschränkte Antigen-Hinweise zu reagieren. Die Verabreichung von OVA1-eingekapselten und OVA2-hybridisierten Antigenen zeigte Unterschiede zwischen den getrennten und kombinierten Formulierungen, wobei die kombinierte DA-SNA 1-Struktur die SFCs bei OVA1-Ex-vivo-Stimulation stärker erhöhte und die separate Formulierung die SFCs bei OVA2 stärker erhöhte Ex-vivo-Stimulation. Wenn wir diese gesamte Studie ganzheitlich betrachten und die Rolle von CD8+ T-Zellen bei der Antitumoraktivität sowie die Bedeutung der wirksamen Aktivierung beider Untergruppen von T-Zell-Antworten berücksichtigen, nutzten wir die kombinierte Abgabe von Antigenen in den DA-SNA-Strukturen für weitere Experimente. Insgesamt zeigen die Ergebnisse bei der Bewertung der Unterschiede in den Immunantworten zwischen den DA-SNAs, dass die Positionierung des MHC-I-beschränkten Antigens in der hybridisierten Architektur die DC-Präsentation für CD8+-T-Zell-Antworten optimiert und gleichzeitig das MHC-II-beschränkte Antigen innerhalb der DA-SNAs einkapselt Der Kern induziert eine geringfügige Steigerung der CD4+-Aktivität und bewahrt gleichzeitig die zytotoxische Funktion.

a, Zeitplan der zweiwöchentlichen Immunisierung für C57BL/6-Mäuse. Verschiedene Behandlungsgruppen in der Studie. Dosis: 6 nmol pro Antigen; 6 nmol Adjuvans. b: Veränderung der CD8+- (links) oder CD4+-T-Zellpopulationen (rechts) in der Milz nach dem Impfschema. c: Die intrazelluläre Produktion des proinflammatorischen Zytokins IFN-γ (links) oder des CD107a-Degranulationsmarkers (Mitte) wurde nach Ex-vivo-Restimulation mit Peptidantigen bewertet. Polyfunktionelle T-Zellen (doppelt positiv für beide Marker) wurden quantifiziert (rechts) für CD8+ (oben) oder CD4+ (unten) T-Zellen. DA-SNA 2 erhöhte die Produktion aller Marker in CD8+-T-Zellen signifikant, während die Unterschiede bei der Produktion in CD4+-T-Zellen subtiler waren, wobei beide DA-SNAs die Werte nachweisbar über die Werte bei Mäusen erhöhten, die mit einem Mischimpfstoff immunisiert wurden. d: Der Effektor-Gedächtnis-Phänotyp, gemessen durch CD44+CD62L−-Marker, wurde durch DA-SNA 2 für CD8+ T-Zellen erhöht (links). Die CD4+-Effektorfunktion (rechts) war für Separate 1 Encap am stärksten erhöht. 2 Hyb. Immunisierung. e, Prozentsatz der CD8+ T-Zellen, die OVA1-spezifisch sind, gemessen durch Färbung mit einem Antigen-spezifischen Dimer. f, Repräsentative Zählungen und Bilder (links) von IFN-γ-sekretierenden Milz-T-Zellen nach verschiedenen Ex-vivo-Stimulationen zusammen mit den gesamten SFCs, gemessen durch den ELISpot-Assay (rechts). Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt. n = 3–6 Mäuse pro Gruppe. Die statistische Signifikanz zwischen relevanten Vergleichen wird angezeigt. Für alle Panels wurde die Signifikanz mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Tukey (b,c,d,f) oder Dunnett (e) berechnet.

Um die möglichen Faktoren zu bewerten, die diese Unterschiede bei der In-vivo-Aktivierung auslösen, haben wir den Verabreichungsweg für die Strukturen bei der Immunisierung untersucht. Wir verabreichten DA-SNAs subkutan mit Fluorophormarkierungen für beide Peptidantigene und beurteilten die Bioverteilung nach 24 Stunden (ergänzende Abbildung 10). Für das hybridisierte Antigen wurden keine signifikanten Unterschiede in der Organakkumulation zwischen den beiden DA-SNAs beobachtet. Das eingekapselte Antigen war hauptsächlich im Lymphknoten konzentriert und wurde nur sehr wenig in anderen wichtigen Organen nachgewiesen. Wichtig ist, dass infolge der DA-SNA 2-Immunisierung ein signifikanter Anstieg der Akkumulation beobachtet wurde. Wir wollten herausfinden, ob der Lymphknotentransport durch einen Unterschied in der Freisetzungsrate der Antigene aus den DA-SNA-Strukturen erklärt werden kann (ergänzende Abbildung 11). Freisetzungsprofile, die in physiologisch relevanten Lösungen (10 % FBS) ex cellulo durchgeführt wurden, zeigten relativ geringe Freisetzungsniveaus für das hybridisierte Antigen innerhalb von 48 Stunden, wohingegen das eingekapselte Antigen eine Freisetzung von über 63 % für DA-SNA 1 und knapp 50 % für DA erreichte -SNA 2. Wir haben jedoch eine SNA-Aufnahme in nur 30 Minuten beobachtet25. Betrachtet man die Freisetzungsprofile der DA-SNAs innerhalb der ersten Stunden nach Serumexposition, weisen die Strukturen die gleichen Freisetzungsraten auf, die ebenfalls <25 % des gesamten verkapselten Antigens betragen. Es wurde bereits früher festgestellt, dass die Stabilität der Liposomenhülle und damit der SNA zu Unterschieden in der Verteilung führt29,36. Wir postulieren, dass die Liposomenstabilität, beeinflusst durch die Peptidladung37,38, zu den beobachteten Unterschieden in der DA-SNA-verkapselten Peptidverteilung führt. Dennoch betonen wir, dass dieser Parameter eine Designüberlegung für die Auswahl der Peptidladung sein sollte, die je nach Antigensatz variiert, und diese Arbeit veranschaulicht wichtige strukturbasierte Impfstoffverbesserungen durch mehrere verschiedene Antigensätze. Wir kommen daher zu dem Schluss, dass die in vivo beobachteten signifikanten immunweiten Veränderungen nicht ausschließlich auf Unterschiede in der Bioverteilung oder den Antigenfreisetzungsraten zwischen den beiden Nanopartikeln zurückzuführen sind. Darüber hinaus können bei der Bewertung des Transports der Antigene in Milz-DCs (ergänzende Abbildung 12) keine Unterschiede zwischen den beiden DA-SNAs aufgelöst werden, und was wichtig ist, beide erzeugen im Vergleich zu naiven Mäusen und naiven Mäusen eine signifikante doppelt positive Antigenpopulation von DCs Mäusen wurde eine einfache Mischung der Komponenten verabreicht. Aufgrund der minimalen Variation zwischen den DA-SNAs basierend auf der Verteilung und dem Handel auf Organebene führten wir eine Transkriptomanalyse dendritischer Zellen durch, um zu bewerten, wie sich die Behandlung mit den unterschiedlich strukturierten Impfstoffen auf die Signalweganreicherung und die gesamte Genexpression auswirkt (ergänzende Abbildung 13 und). Datensatz 1). Die DA-SNA-Strukturen wirken sich ganz anders auf die Signalwege dendritischer Zellen aus als bei der Admix-Behandlung, bei der nur wenige signifikante Signalwege angereichert wurden. Die Analyse der Signalweganreicherung zwischen DA-SNA 1 und 2 legt nahe, dass DA-SNA 2 die Internalisierung und Signalverarbeitung von Komponenten stärker beeinflusst als DA-SNA 1.

Wir haben versucht, die Verarbeitungswege von DA-SNA 1 und 2 in dendritischen Zellen aufzuklären, um diesen Einfluss auf die Signalkinetik aufzuklären. Mithilfe der konfokalen Mikroskopie (Abb. 3) beurteilten wir das intrazelluläre Schicksal von DA-SNAs nach der Aufnahme durch BMDCs zu festgelegten Zeitpunkten und verglichen die Co-Lokalisierung sowohl der hybridisierten als auch der eingekapselten Antigene mit Organellenmarkern für frühe Endosomen (frühes Endosomenantigen 1). , EEA1), spätes Endosom (Rab7), Lysosom (lysosomal assoziiertes Membranprotein 1, Lamp1), endoplasmatisches Retikulum (Proteindisulfidisomerase, PDI), MHC-I und MHC-II. Die Daten verdeutlichen, dass eine wesentliche Verarbeitung zu früheren Zeitpunkten (d. h. <1 Stunde) erfolgt. Die Verarbeitung innerhalb des frühen Endosoms zeigt eine vergleichbare Kinetik zwischen den beiden Strukturen (Abb. 3a). Signifikante Unterschiede zwischen den beiden Strukturen treten im späten Endosom auf (Abb. 3b), wo es im Vergleich zu beiden Antigenen für DA-SNA 1 zu einer verstärkten Verarbeitung und einem verstärkten Transport sowohl der hybridisierten als auch der eingekapselten Antigene für die DA-SNA 2-Struktur kommt das Lysosom zeigte wesentliche Unterschiede; Es gibt eine verringerte Co-Lokalisierung für das hybridisierte Antigen von DA-SNA 2 (MHC-I-beschränkt) und eine erhöhte Co-Lokalisierung für das eingekapselte Antigen für DA-SNA 2 (MHC-II-beschränkt) (Abb. 3c), was darauf hindeutet Optimierung der MHC-II-Beladung für DA-SNA 2. Wir beobachteten, dass das hybridisierte Antigen von DA-SNA 1 (MHC-II-beschränkt) zu frühen Zeitpunkten zwar eine erhöhte Co-Lokalisierung mit dem Lysosom aufweist, diese jedoch schnell nachlässt und nicht signifikant ist Zuwächse werden später in der Studie beobachtet. Dies deutet auch darauf hin, dass alle DA-SNA 1-optimierten Verarbeitungswege vorübergehender sind, da auch keine erhöhte Co-Lokalisierung des DA-SNA 1-hybridisierten Antigens (MHC-II-beschränkt) mit MHC-II beobachtet wird. Die Analyse der Verarbeitung am endoplasmatischen Retikulum (ER) zeigte keine wesentlichen Unterschiede zwischen der DA-SNA-Behandlung der hybridisierten Antigene. Dies könnte auf eine schnellere Kreuzpräsentationskinetik mit der DA-SNA 2-Strukturanordnung für das hybridisierte Antigen und damit auf eine weniger effektive Erfassung dieses Prozesses zurückzuführen sein (Abb. 3d). Umgekehrt könnte eine verringerte Co-Lokalisierung des ER- und DA-SNA-2-verkapselten Antigens (MHC-II-beschränkt), die zum Zeitpunkt von 1 Stunde signifikant ist, auf einen verringerten Transport des verkapselten MHC-II-beschränkten Antigens für DA-SNA zurückzuführen sein 2 in die Notaufnahme. Wichtig ist, dass das hybridisierte Antigen von DA-SNA 2 (MHC-I-beschränkt) zu frühen Zeitpunkten (bereits nach 30 Minuten) eine erhöhte Co-Lokalisierung mit MHC-I aufwies, wobei signifikante Anstiege bis zu 1 Stunde beobachtet wurden (Abb. 3e). Dies führt zu einer erhöhten DA-SNA 2-gesteuerten OVA1-Oberflächenpräsentation auf MHC-I (ergänzende Abbildung 14). Obwohl dies nicht signifikant ist, gibt es zu späteren Zeitpunkten einen tendenziellen Anstieg des in DA-SNA 2 eingekapselten Antigens (MHC-II-beschränkt) mit MHC-II (Abb. 3f). Da es eine signifikante Co-Lokalisierung des in DA-SNA 2 eingekapselten Antigens (MHC-II-beschränkt) mit dem späten Endosom und Lysosom gibt, schlagen wir vor, dass die Beladung mit MHC-II durch DA-SNA-Inkubation ein langsamerer Prozess ist als die Beladung mit MHC-I . Darüber hinaus ließen die Unterschiede zwischen den DA-SNA-Behandlungen im Allgemeinen nach 6 Stunden nach, was darauf hindeutet, dass die beobachteten immunologischen Unterschiede hauptsächlich auf die frühe Kinetik und Verarbeitung dieser Strukturen durch DCs zurückzuführen sind.

Repräsentative konfokale Mikroskopbilder (oben) von BMDCs, die 30 Minuten lang entweder mit DA-SNA 1 (links) oder DA-SNA 2 (rechts) inkubiert wurden und sowohl Cy5-markiertes hybridisiertes Antigen (rot) als auch FITC-markiertes eingekapseltes Antigen (grün) enthalten. Der Kern wurde mit DAPI (blau) gefärbt und die folgenden Organellen wurden gefärbt: a, EEA1 (frühes Endosom); b, Rab7 (spätes Endosom); c, Lamp1 (Lysosom); d, PDI (endoplasmatisches Retikulum); e, MHC-I; f, MHC-II. Alle Organellen sind gelb dargestellt. Dargestellt sind die Überlappungskoeffizienten von Mander (unten), die den Anteil des Cy5- oder FITC-Signals darstellen, das mit den jeweiligen Organellen nach 0,5, 1, 6 und 24 Stunden kolokalisiert ist. Maßstabsbalken, 10 μm. g,i, Co-Lokalisierung und h,j, Durchflusszytometrieanalyse der DA-SNA 1- und DA-SNA 2-Prozessierung in BMDCs nach einem 1-stündigen Puls und nach 24-stündiger Behandlung mit Chloroquin (g,h) und Brefeldin A (i ,J). Dargestellt ist die Co-Lokalisierung von OVA1 mit MHC-I (g) und ER (i). k,l, Co-Lokalisierung von OVA2 mit Lysosom in Gegenwart von Leupeptin (k) und MHC-II in Gegenwart von Chloroquin (l). Für a–f zeigen die Daten den Mittelwert ± sd aus 6–10 zufällig ausgewählten Sichtfeldern. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe einer zweifaktoriellen ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Sidak berechnet. Für g–l zeigen die Daten Mittelwert ± Standardabweichung für n = 3–6 Replikate. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe eines ungepaarten t-Tests mit Welch-Korrektur (g,i,k,l) ​​und einer einfaktoriellen ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest (h,j) berechnet.

Um die an der DA-SNA 1- und 2-Antigenpräsentation beteiligten Wege weiter aufzuklären, verwendeten wir Inhibitoren, um die Antigenverarbeitung mechanistisch zu bewerten. Die Zugabe eines Disruptors der endosomalen Ansäuerung (Chloroquin)39, der nachweislich das Ausmaß der Kreuzpräsentation39,40 erhöht, beeinflusst die Co-Lokalisierung von OVA1 mit MHC-I-Komplexen. Durch diese verstärkte Kreuzpräsentation beobachten wir, dass DA-SNA 2 eine erhöhte Co-Lokalisierung von OVA1 mit MHC-1 induziert (Abb. 3g). Diese Daten legen nahe, dass DA-SNA 2 die verbesserte Kreuzpräsentation effektiver nutzen kann als DA-SNA 1. Dieser architektonische Vorteil führt letztendlich zu einer größeren Oberflächenpräsentation von OVA1 auf MHC-I (Abb. 3h). Die Zugabe von Brefeldin A, das den Transport zusammengesetzter Peptid-MHC-I-Komplexe vom ER zur Zellmembran41 hemmt und somit die Kreuzpräsentation behindert, wirkt sich stärker negativ auf DA-SNA 2 aus. Es kommt zu einer signifikanten Abnahme (4,7-fach). bei der Co-Lokalisierung des OVA1-Peptids mit dem ER nach Brefeldin A-Behandlung für DA-SNA 2 (Abb. 3i), was zu einem vollständigen Verlust der OVA1-Oberflächenpräsentation auf MHC-I führt (Abb. 3j). Der Einfluss von Pathway-Inhibitoren auf die OVA2-Verarbeitung wurde ebenfalls analysiert. Die Zugabe von Leupeptin, einem Inhibitor von Cystein- und Serinproteasen (z. B. Cathepsine B, S und L)42, führt zu einem Rückgang der OVA2-Co-Lokalisierung mit dem Lysosom (der Stelle der MHC-II-Beladung) für DA-SNA 2 (Abb. 3k). Die Antigenpräsentation durch DA-SNA 2 wird daher bei der MHC-II-Prozessierung durch die Zugabe von Inhibitoren stärker beeinträchtigt. Darüber hinaus behindert die Verwendung von Chloroquin, von dem bekannt ist, dass es die MHC-II-abhängige Antigenverarbeitung blockiert, die Fähigkeit von OVA2 in DA-SNA 2, sich gemeinsam mit MHC-II zu lokalisieren (Abb. 3l). DA-SNA 2 wird daher durch die Zugabe von Inhibitoren, die die MHC-I- und -II-Prozessierung stören, stärker beeinflusst, was darauf hindeutet, dass die Präsentation und die kinetischen Profile, die DA-SNA 2 bietet, optimaler für die Antigenverarbeitung geeignet sind.

Um zu verstehen, wie die verschiedenen DA-SNAs und Beimischungsbehandlungen so unterschiedliche Downstream-T-Zell-Reaktionen hervorriefen, sammelten und isolierten wir CD8+- und CD4+-T-Zellen der Milz nach der Immunisierung nach dem gleichen Schema in Abb. 2 und führten eine Massen-RNA-Sequenzierung (RNAseq) durch. Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) ergab ganzheitlich, dass die CD8+- und CD4+-T-Zell-Genexpressionsprofile von Mäusen, die mit Beimischungsformulierungen immunisiert wurden, denen von naiven Mäusen am ähnlichsten waren, was darauf hindeutet, dass dies die Ursache für die geringe Gesamtaktivierung ist (Abb. 4a). Mit DA-SNA 2 immunisierte Mäuse unterschieden sich in ihrem CD8+-Transkriptom am stärksten von naiven Mäusen, während sich DA-SNA 1 und 2 in ähnlicher Weise in ihren Genexpressionsprofilen in CD4+-T-Zellen von naiven Mäusen unterschieden. Dies legt eine Erklärung für die signifikanten Steigerungen der durch DA-SNA 2 induzierten CD8+-T-Zellfunktion, aber ähnliche Niveaus der CD4+-T-Zellfunktion zwischen beiden DA-SNAs nahe, die in Abb. 2 beobachtet wurden. Darüber hinaus wurden Gene für DA-SNA 2-immunisierte Mäuse unterschiedlich reguliert zeigten bei beiden T-Zelltypen im Vergleich zu den anderen Behandlungen größere absolute logarithmische Faltungsänderungen (LFCs), wobei die Anzahl der unterschiedlich regulierten Gene infolge der DA-SNA 2-Immunisierung im Vergleich zu DA-SNA 1 mindestens doppelt so hoch war (Abb. 4b). . Differenziell regulierte Gene wurden in Signalwegen angereichert, die Entzündungsreaktionen und die Hochregulierung entzündungsfördernder Zytokine, Chemotaxis und Migration wichtiger Immunzellpopulationen beinhalten (Abb. 4c und ergänzender Datensatz 2). Während einige der angereicherten Signalwege der DA-SNA 2-Behandlung mit der Admix-Behandlung und andere mit der DA-SNA 1-Behandlung geteilt wurden, korrelierte die auf Transkriptomebene für die DA-SNA 2-Architektur induzierte weitverbreitete Aktivierung insgesamt mit verbesserten immunologischen Ergebnissen .

a, PCA-Diagramm aus dem vollständigen Transkriptom von CD8+- (links) und CD4+-T-Zellen (rechts). b: Veränderungen der Genexpression, dargestellt durch Teilmengen von LFCs für CD8+- (links) und CD4+-T-Zellpopulationen (rechts) als Ergebnis verschiedener Behandlungen. c, Auswahl signifikant angereicherter Pfade, berechnet mithilfe der GSEA-Analyse. Die Farben der Quadrate entsprechen dem Anreicherungsscore für jeden Signalweg als Ergebnis unterschiedlicher Behandlungen für CD8+- (links) und CD4+-T-Zellen (rechts). d, Gensignaturen für CD8+ (oben) und CD4+ (unten) T-Zellen. Die Farben beziehen sich auf normalisierte (z-bewertete) Genexpressionsniveaus. Auswahl relevanter Gene markiert. e, Vulkandiagramme von CD8+- (links) und CD4+-T-Zellen (rechts) zwischen einem paarweisen Vergleich von DA-SNA 2 und DA-SNA 1. Farbige Punkte zeigen signifikant exprimierte Gene an; Ein positiver LFC zeigt eine Hochregulierung für DA-SNA 2 im Vergleich zu DA-SNA 1 (rot) an, während ein negativer LFC eine Herunterregulierung für DA-SNA 2 im Vergleich zu DA-SNA 1 (blau) anzeigt.

Relevante Gensignaturen wurden für die adaptive und angeborene Immunaktivierung und -funktion bei allen Behandlungen identifiziert und umfassen beispielsweise CXCR3, TNFSF9 und GZMK (Abb. 4d und ergänzender Datensatz 3). Diese Gene haben besondere Bedeutung für die Funktion und den Transport von T-Zell-Effektoren, die Antigenpräsentation und die Erzeugung zytotoxischer T-Zellen bzw. die zytolytische Funktion von Helfer-T-Zellen. Ein spezieller Vergleich von DA-SNA 2 mit DA-SNA 1 zeigt einzigartige, im Nanomaßstab induzierte genetische Unterschiede, indem einfach die Platzierung der Antigenklasse geändert wird (Abb. 4e). Zwischen beiden DA-SNAs wurden insgesamt 452 bzw. 229 überlappende signifikante Gene in CD8+- bzw. CD4+-T-Zellen nachgewiesen. Insbesondere induzierte DA-SNA 2 im Vergleich zu DA-SNA 1 eine höhere Expression von IL2RA, CD44 und Die Struktur des Impfstoffs und insbesondere die Platzierung von Antigenen im Nanomaßstab haben Einfluss auf das Genom und die Expressionsmuster. Diese Ergebnisse unterstreichen die festgestellten immunologischen Messungen, liefern eine mechanistische Begründung, die Wege hervorhebt, die zur T-Zell-Aktivierung und dauerhaften Reaktionen führen, und beschreiben einen Rahmen für das Impfstoffdesign unter Verwendung gezielter Strukturüberlegungen.

Um die therapeutische Wirksamkeit und immunologische Wirkung von DA-SNAs zu bewerten, verwendeten wir ein murines E.G7-OVA-Lymphomkrebsmodell aufgrund seiner stabilen Expression des OVA-Proteins, das sowohl die oben verwendeten OVA1- als auch OVA2-Epitope exprimiert46. Kurz gesagt, C57BL/6-Mäuse wurden subkutan mit E.G7-OVA-Zellen geimpft und wöchentlich entweder mit DA-SNA oder Beimischungsformulierungen (6 nmol jedes OVA1- und OVA2-Antigens, 6 nmol Adjuvans-DNA) immunisiert (Abb. 5a). Tumortragende Mäuse, die mit DA-SNA 2 immunisiert wurden, zeigten bereits 5 Tage nach der zweiten Immunisierung (Tag 15) und mehr als 16 Tage nach der zweiten Immunisierung (Tag 15) eine etwa dreifache Verringerung des Tumorwachstums im Vergleich zur Kontrollgruppe (mit Kochsalzlösung behandelt) und zur Mischgruppe -facher Unterschied im Tumorwachstum im Vergleich zu mit Kochsalzlösung behandelten Mäusen 22 Tage nach der Tumorimpfung (Abb. 5b und ergänzende Abb. 15). Wichtig ist, dass die Behandlung mit DA-SNA 1 das Tumorwachstum im Vergleich zur Behandlung mit Admix im Gegensatz zur Behandlung mit DA-SNA 2 nicht wirksam stoppte. Verglichen mit der Beimischung und DA-SNA 1 führte DA-SNA 2 am 24. Tag zu einer etwa siebenfachen Verringerung des Tumorwachstums, was den deutlichen Einfluss der Antigenpositionierung unterstreicht und letztendlich zu einer signifikanten Verlängerung des Überlebens der Tiere (medianes Überleben) führte in Tagen: PBS = 27; Admix = 24; DA-SNA 1 = 28; DA-SNA 2 = 35) (Abb. 5c). Um die physikalischen Auswirkungen der Behandlung auf das Tumorwachstum weiter zu untersuchen, wurden Tumore am 15. Tag nach dem gleichen Behandlungsschema aus Mäusen herausgeschnitten und anschließend gewogen (Abb. 5d und ergänzende Abb. 16). Interessanterweise zeigten beide SNA-Gruppen an diesem Punkt der Tumorwachstumskurve eine signifikante Verringerung des Tumorgewichts im Vergleich zu mit PBS behandelten Mäusen, was darauf hindeutet, dass DA-SNA 1 in der Lage ist, eine Antitumor-Immunantwort auszulösen, diese Reaktion ist jedoch nicht so dauerhaft wie der von DA-SNA 2 erzeugte.

a–c, C57BL/6-Mäuse wurden subkutan (a) mit E.G7-OVA-Zellen (5 × 105) in der rechten Flanke geimpft und erhielten ab Tag 3 wöchentliche Immunisierungen für insgesamt vier Impfungen (6 nmol Adjuvans, 6 nmol jedes Antigens). Dargestellt sind durchschnittliche Wachstumskurven (b) und Tierüberleben (c). P-Werte für das Volumen am Tag 24 von DA-SNA 2 im Vergleich zu DA-SNA 1 und Admix (b). Die Daten zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung aus zwei unabhängigen Experimenten mit n = 7–9. d, Gewichte gemäß dem in a dargestellten Behandlungsplan (am Tag 15). e, Links: Auswertung der Immun-CD8+-T-Zellen in der Milz am Ende des Experiments. Rechts: Verhältnis von CD8+/CD4+ T-Zellen. f–i, Durchflusszytometrische Analyse am Tag 15 von PBMCs, die aus tumortragenden Mäusen gemäß dem in a dargestellten Schema isoliert wurden. f, CD8+ T-Zellen, die spezifisch für das OVA1-Antigen sind. g, Effektor-Gedächtnis-CD8+-T-Zellen (CD44+/CD62L−) innerhalb dieser Antigen-spezifischen T-Zell-Untergruppe. h, CD4+ T-Zellen, die spezifisch für das OVA2-Antigen sind. i, Effektorgedächtnis-CD4+-T-Zellen (CD44+/CD62L−). Die Daten zeigen Mittelwert ± Standardabweichung mit n = 4–6 Mäusen pro Gruppe. Für b, d–g und i wurde die Signifikanz mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest berechnet. Panel h verwendete eine Welch-ANOVA, gefolgt von Dunnetts Mehrfachvergleichstest, da es zwischen den Gruppen signifikante Unterschiede in der Standardabweichung gab. Panel c wurde mithilfe eines Log-Rank-Tests analysiert.

Quelldaten

Die immunologischen Unterschiede, die sich aus der Verabreichung mehrerer Antigene ergeben, wurden weiter aufgeklärt, indem Milzen von E.G7-OVA-tumortragenden Mäusen gesammelt und Veränderungen in CD8+- und CD4+-T-Zellen der Milz untersucht wurden (Abb. 5e). Die Milzen von DA-SNA 2-behandelten Mäusen erzeugten im Vergleich zu anderen Behandlungsgruppen einen deutlich höheren Prozentsatz an CD8+ T-Zellen und zeigten auch insgesamt ein höheres Verhältnis von CD8+ zu CD4+ T-Zellen. Um die immunologischen Unterschiede zu bewerten, die zur Tumorsuppression beitrugen, wurden tumortragende C57BL/6-Mäuse am 15. Tag auf zirkulierende mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) untersucht, als erstmals Unterschiede im Tumorwachstum beobachtet wurden und als die Wirkung von DA-SNA 2 einsetzte Die Behandlung begann, das Tumorwachstum zu stoppen, während die anderen Behandlungen vernachlässigbare Auswirkungen hatten. Bemerkenswerterweise zeigten DA-SNA 2-behandelte Mäuse den höchsten Anteil an zirkulierenden Antigen-spezifischen CD8+ T-Zellen (Abb. 5f, Gating-Strategie in ergänzender Abb. 17). Diese Untergruppe von CD8+-Lymphozyten wurde weiter auf ihren Gedächtnisphänotyp untersucht. In diesem Fall erhöhte die DA-SNA 2-Behandlung den Effektor-Gedächtnis-Phänotyp signifikant auf über 60 % der OVA1-spezifischen zirkulierenden CD8+-T-Zellen (Abb. 5g). Antigenspezifische CD4+-T-Zellen waren bei Mäusen, die mit DA-SNAs behandelt wurden, ebenfalls signifikant erhöht (Abb. 5h). Aufgrund der zuvor hier für CD4+ T-Zellen untersuchten Transkriptomprofile und immunologischen Parameter gab es erwartungsgemäß vernachlässigbare Unterschiede zwischen den beiden DA-SNA-Gruppen. Obwohl es nicht genügend OVA2-spezifische CD4+-T-Zellen gab, um den Gedächtnisphänotyp innerhalb dieser Subpopulation genau abzugrenzen, zeigte die Gesamtheit der CD4+-T-Zellen bei Behandlung mit DA-SNA 1 einen verbesserten Effektor-Gedächtniszustand (~30 % der CD4+-T-Zellen im Vergleich). unter Behandlung mit DA-SNA 2, wodurch etwa 10 % der CD4+-T-Zellen reiften (Abb. 5i).

Um die Vielseitigkeit und Übersetzbarkeit der Entwurfsregeln zur Steuerung der strukturellen Platzierung für die Impfung mit mehreren Antigenen zu bestimmen, verwendeten wir das MC-38-Dickdarmkarzinommodell, das für seine hohe Mutationslast bekannt ist47. Kurz gesagt, C57BL/6-Mäuse wurden subkutan mit MC-38-Zellen geimpft und wöchentlich mit DA-SNAs immunisiert, die das MHC-I-Neoantigen „Adpgk I“14 und „Adpgk II“ enthielten, ein Antigen, von dem vorhergesagt wurde, dass es effektiv an MHC-II bindet (https: //www.iedb.org und Refs. 48,49,50) (jeweils 6 nmol Adpgk I- und Adpgk II-Antigen, 6 nmol Adjuvans-DNA) (Extended Data Abb. 3a–c). Das Tumorwachstum wurde in ähnlicher Weise bei mit DA-SNA 2 immunisierten Mäusen gehemmt, wobei diesen Tieren eine signifikante Verlängerung des Überlebens verliehen wurde (mittlere Überlebenszeit in Tagen: PBS = 27; DA-SNA 2 = 38). Diese Unterschiede resultieren wahrscheinlich aus einer Kombination signifikanter Zunahmen der Tumormikroumgebung und der erhöhten zirkulierenden Immunzellen. CD8+- und CD4+-T-Zellen waren in der Mikroumgebung des Tumors erhöht (Extended Data Abb. 3d, e, Gating-Strategie in ergänzender Abb. 18) und es wurde eine signifikante Verringerung der von Gr-1+CD11b+ aus dem Myeloid stammenden Suppressorzellen beobachtet (Extended Data Abb. 3f). Darüber hinaus erhöhte die DA-SNA 2-Behandlung den Prozentsatz an Adpgk I-spezifischen CD8+ T-Zellen und induzierte eine adaptive T-Zell-Immunität der Milz. Bei der Ex-vivo-Stimulation von Adpgk I und II sezernierten DA-SNA 2-behandelte Splenozyten mehr Interferon-Gamma als DA-SNA 1- oder PBS-behandelte Splenozyten (Extended Data Abb. 3g, h).

Die bisherigen Erkenntnisse zur DA-SNA-Struktur wurden verwendet, um die Fähigkeit der Dual-Antigen-Platzierung zu bewerten, das Wachstum von B16-F10-Melanomtumoren zu beeinflussen. Dieses Modell hat sich als äußerst aggressiv mit verbesserten immunsuppressiven Eigenschaften erwiesen51. Die kürzlich gemeldeten 52 M27- und M30-Neo-Epitope, die Mutationen enthalten, die nur im Tumor vorhanden sind, wurden als MHC-I- bzw. MHC-II-Antigene ausgewählt. Anfänglich zeigten C57BL/6-Mäuse, die mit B16-F10-Tumorzellen geimpft wurden und 3 Tage nach der Tumorimpfung eine wöchentliche Impfung mit entweder DA-SNA 1 oder DA-SNA 2 erhielten, am Tag 17 eine Hemmung des Tumorwachstums im Vergleich zu mit Kochsalzlösung behandelten Mäusen (68 % bzw. 48 %) (Abb. 6a, b). Tatsächlich wurde bei Mäusen, die mit beiden DA-SNAs behandelt wurden, im Vergleich zur Behandlung mit Kochsalzlösung ein statistisch signifikanter ~4-facher Anstieg der zirkulierenden Effektor-Gedächtnisantigen-spezifischen CD8+-T-Zellen beobachtet (Abb. 6c, Gating-Strategie in ergänzender Abb. 17). Daher wird eine Antigen-spezifische Immunantwort erzeugt, aber die vernachlässigbare Auswirkung, die diese auf das Tumorwachstum hat, weist auf die Wahrscheinlichkeit einer stark immunsuppressiven Tumorumgebung hin, die das therapeutische Potenzial dieser T-Zellen hemmt.

a,b, C57BL/6-Mäuse wurden subkutan (a, oben) mit B16-F10-Zellen (105) in der rechten Flanke geimpft und erhielten ab Tag 3 wöchentliche subkutane Immunisierungen für insgesamt vier Impfungen (9 nmol Adjuvans, 9 nmol jedes Antigens). Dargestellt sind durchschnittliche Wachstumskurven (a, unten) und Tierüberleben (b). c, CD8+-T-Zellen, die für das M27-Antigen spezifisch sind, und Gedächtnis-CD8+-T-Zellmarker 44+/62– in isolierten PBMCs. Die Daten zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung aus zwei unabhängigen Experimenten mit n = 6–7. d,e, B16-F10-tumortragende Mäuse, die wöchentlich subkutane Immunisierungen mit DA-SNAs in Kombination mit einem Anti-PD-1-Immun-Checkpoint-Inhibitor erhielten, der 3 und 6 Tage nach der DA-SNA-Immunisierung intraperitoneal verabreicht wurde. Dargestellt sind durchschnittliche Wachstumskurven (d) und Tierüberleben (e). Angezeigte P-Werte für das Wachstum im Vergleich von Anti-PD-1 mit DA-SNA 2 + Anti-PD-1 an den Tagen 17, 20 und 22. Die Daten zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung aus zwei unabhängigen Experimenten mit n = 9–15. f–k, Durchflusszytometrische Analyse am Tag 17 von PBMCs, die aus tumortragenden Mäusen isoliert wurden, die den in d angegebenen Zeitplan erhielten. f, Bewertung zirkulierender CD8+ T-Zellen. g: Gesamtes Effektorgedächtnis CD8+ T-Zellen (CD44+/62L−). h, M27-spezifische CD8+/CD19− T-Zellen. i, Quantifizierung zirkulierender CD4+ T-Zellen. j, Bewertung der Effektorgedächtnis-CD4+-T-Zellen (CD44+/62L−). k, M30-spezifische CD4+/CD19− T-Zellen. Die Daten zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung von n = 5–6 Mäusen pro Gruppe. Für alle Panels außer b und e wurde die Signifikanz mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest berechnet. Das Überleben der Tiere (b, e) wurde mithilfe eines Log-Rank-Tests analysiert. Hashtags in d weisen auf statistisch signifikante Unterschiede zwischen DA-SNA 2 + Anti-PD-1- und Anti-PD-1-Behandlungsgruppen hin. ND, nicht erkannt.

Quelldaten

Aufgrund dieser Beobachtungen und der inhärenten Aggressivität dieses Tumormodells wurden DA-SNA-Behandlungen mit dem Immun-Checkpoint-Inhibitor Anti-PD-1 kombiniert, einer von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen Behandlung für fortgeschrittenes Melanom die Immunsuppression des Tumors überwinden53,54. Diese Behandlungen begannen 3 Tage nach der B16-F10-Tumorimpfung. Bemerkenswert ist, dass bei gleichzeitiger Verabreichung von Anti-PD-1 und DA-SNAs bereits 17 Tage nach der Tumorimpfung bei Tieren, die mit der Kombination DA-SNA 2 + Anti-PD- behandelt wurden, ein signifikanter Rückgang des Tumorwachstums beobachtet wurde. 1-Therapie, während bei Mäusen in den anderen Behandlungsgruppen kein wesentlicher Rückgang des Tumorwachstums beobachtet wurde (Abb. 6d und ergänzende Abb. 19). Dies führte zu einer Verlängerung des mittleren Überlebens dieser Mäuse um 40 % im Vergleich zu denen in den mit Kochsalzlösung oder Anti-PD-1-Monotherapie behandelten Gruppen (Abb. 6e). Aus diesen Ergebnissen lässt sich die Bedeutung und Rolle ableiten, die die Platzierung von Antigenen im Nanomaßstab bei der Förderung synergistischer und verstärkter Immunantworten spielt. Wichtig ist, dass ein Vergleich zwischen DA-SNA-Kombinationsbehandlungsgruppen eine Verbesserung des mittleren Gesamtüberlebens für kombinierte DA-SNA 2 + Anti-PD-1-Tiere ergab (P = 0,0507). Die Auswertung von aus peripherem Blut isolierten Immunzellen verdeutlicht diesen strukturbedingten Unterschied, bei dem DA-SNA 2 synergistisch mit dem Checkpoint-Inhibitor zu wirken scheint. Im Vergleich zu allen anderen Gruppen wurde ein signifikanter Anstieg der zirkulierenden CD8+ T-Zellen bei Tieren beobachtet, die eine Kombinationsbehandlung mit DA-SNA 2 + Anti-PD-1 erhielten (Abb. 6f). Interessanterweise wurden bei der Auswertung der gesamten CD8+-Effektorgedächtnis-T-Zellpopulation unter diesen zirkulierenden PBMCs signifikante Anstiege für beide Kombinationsgruppen aus DA-SNA + Anti-PD-1 festgestellt, wobei DA-SNA 2 + Anti-PD-1 ein Effektorgedächtnis erzeugte Phänotypen in ~60 % der zirkulierenden CD8+ T-Zellen (Abb. 6g). Darüber hinaus konnte nur diese Kombinationsbehandlung mit DA-SNA 2 + Anti-PD-1 eine robuste Antigen-spezifische CD8+-T-Zell-Antwort induzieren (Abb. 6h). Beobachtungen der CD4+-T-Zellzirkulation zeigten einen ähnlich hohen Anstieg als Ergebnis der Kombinationstherapie mit DA-SNA 2 + Anti-PD-1 (Abb. 6i), obwohl beide Kombinationsgruppen mit DA-SNA + Anti-PD-1 den Effektor signifikant erhöhten Gedächtnisphänotyp auf ~28 % der CD4+-T-Zellpopulation (Abb. 6j). Die kombinierte DA-SNA 2 + Anti-PD-1-Behandlung erhöhte die Produktion antigenspezifischer CD4+ T-Zellen zusammen mit der Anti-PD-1-Monotherapie im Vergleich zur DA-SNA 1 + Anti-PD-1-Behandlung, signifikante Unterschiede gab es jedoch nicht zwischen Gruppen beobachtet (Abb. 6k).

Obwohl umfangreiche Forschungsarbeiten die Bedeutung von Adjuvanzien und Antigenen bei der Entwicklung neuer Immuntherapien untersucht haben, wurde die Bedeutung der strukturellen Präsentation mehrerer Antigene innerhalb eines bestimmten Konstrukts und ihre Rolle bei der Auslösung einer starken und gewünschten Immunantwort bisher nicht untersucht. In dieser Arbeit haben wir gezeigt, dass die Platzierung des Antigens für die Wirksamkeit des Impfstoffs ebenso entscheidend sein kann wie die Wahl des Antigens. Tatsächlich ändert sich der Behandlungsnutzen gegen Tumore dramatisch, wenn die Platzierung von MHC-I-beschränkten und MHC-II-beschränkten Antigenen in zwei in ihrer Zusammensetzung nahezu identischen Impfstoffen geändert wird. Ein Impfstoff ist wirksam und der andere unwirksam. Der Ursprung dieser Unterschiede kann darin liegen, dass die Positionierung des Antigens den Verarbeitungsweg, den es in einer Immunzelle durchläuft, sowie seine Verweilzeit in verschiedenen Zellkompartimenten beeinflusst. Durch die Veränderung des Verarbeitungswegs und dieser Signalkinetik wirkt sich dies auf die resultierende Immunantwort auf genetischer, zellulärer und organisatorischer Ebene aus. Ein eingekapseltes MHC-II und ein hybridisiertes MHC-I-beschränktes Antigen regulieren Gene hoch, die für Entzündungsreaktionen, Chemotaxis und Migration wichtiger Immunzellen spezifisch sind und zusammen die Aktivität der Immunzellen beeinflussen. Diese strukturell definierten genetischen Unterschiede wirken sich auf das immunologische Verhalten bei wiederholter In-vivo-Immunisierung aus und definieren letztendlich die Tumorwachstumsprofile in mehreren Tumormodellen, einschließlich E.G7-OVA-Lymphom und klinisch relevantem MC-38-Dickdarmkarzinom und B16-F10-Melanom der Maus Tumorsysteme. Dies ist ein wichtiger Beweis für den Einfluss der Positionierung von Impfantigenen auf mehrere zelluläre Prozesse.

Bei der Entwicklung von Impfstoffen lag der Schwerpunkt auf der Zusammensetzung, Anzahl und Art des Antigens sowie dem Verhältnis dieser Komponenten, wobei der strukturellen Darstellung nahezu keine Beachtung geschenkt wurde. Es ist klar, dass zusätzlich zu diesen wichtigen Parametern die Präsentation des Antigens ein Schwerpunkt bei der zukünftigen Impfstoffentwicklung sein muss. Die Fähigkeit, die Antigenpräsentation so zu optimieren, dass sie einem gewünschten Signalprofil entspricht, ist von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung wirksamer zukünftiger Impfstoffe, bei denen kleine Impfstoffänderungen bei der Antigenplatzierung die Zell-Zell-Kommunikation, den Cross-Talk und die Zellsynergie erheblich verbessern. Diese Erkenntnisse können sowohl für noch zu entdeckende als auch für bereits genutzte Ziele genutzt werden. Zusammengenommen bieten die in dieser Arbeit erzielten Entwicklungen einen Weg nach vorne, um die Gestaltung von Impfstoffen gegen Krebs und andere Krankheiten zu überdenken.

Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Reagenzien kommerziell erworben und wie erhalten verwendet. Oligonukleotide wurden wie unten beschrieben synthetisiert. Peptide wurden von Genscript oder dem Peptide Synthesis Core von Northwestern erworben. Die Chemikalien wurden von den in Klammern aufgeführten Lieferanten bezogen. C57BL/6-Mäuse und weibliche C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J (OT1, 003831)-Mäuse im Alter von 8–12 Wochen wurden vom Jackson Laboratory gekauft. Mäuse wurden in Übereinstimmung mit allen nationalen und lokalen Richtlinien und Vorschriften verwendet und die durchgeführten Protokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Northwestern University genehmigt. E.G7-OVA- und B16-F10-Zellen wurden von ATCC gekauft. MC-38-Zellen wurden freundlicherweise von Dr. Bin Zhang zur Verfügung gestellt. Antikörper wurden gekauft und Klone sind in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführt.

Oligonukleotide wurden auf einem ABI 394-Synthesizer unter Verwendung der Standard-Phosphoramidit-Chemie mit Phosphat- oder Phosphorothioat-Grundgerüsten wie angegeben synthetisiert (Ergänzungstabelle 1). Nach der Synthese wurden die Stränge mit einer 1:1-Lösung aus 37 % Ammoniumhydroxid/40 % Methylamin bei 55 °C für 35 Minuten entschützt, es sei denn, sie enthielten einen Farbstoff; in diesem Fall wurden sie mit 37 % Ammoniumhydroxid bei Raumtemperatur entschützt (rt) über Nacht. Die Stränge wurden dann unter Verwendung einer C18- oder C4-Säule (für Stränge, die Farbstoff oder Cholesterin enthielten) mittels Umkehrphasen-HPLC gereinigt und die Peaks wurden als Fraktionen gesammelt. Die Dimethoxytritylgruppe (DMT) wurde durch einstündige Inkubation in 20 %iger wässriger Essigsäure bei Raumtemperatur von den Produktsträngen entfernt, gefolgt von drei Wäschen mit Ethylacetat, um DMT zu entfernen. Das Endprodukt wurde lyophilisiert und in entionisiertem Wasser (diH2O) resuspendiert. Die Konzentration wurde mithilfe der UV-Vis-Absorption bei 260 nm gemessen, wobei die Extinktionskoeffizienten mit dem Online-Tool IDT OligoAnalyzer berechnet wurden (in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt).

Thiol-funktionalisierte Oligonukleotide in DiH2O wurden reduziert, um ein freies Thiol für zukünftige Reaktionen zu erzeugen. Die Reduktion erfolgte unter Verwendung von Dithiothreitol (100 mM, DTT, Sigma), gelöst in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH 8,5, bei einer Endkonzentration von 100 mM bei Raumtemperatur für 45 Minuten. Diese Lösung wurde in einem Spinfilter mit einer Molekulargewichtsgrenze (MWCO) von 3 kDa (Amicon) mindestens dreimal mit DiH2O gewaschen. Für OVA-Peptidkonjugate wurde das Peptid auf Harz gekauft und jeweils dreimal mit Dimethylformamid (DMF) und Aceton gewaschen, bevor 5 µmol bei Raumtemperatur über Nacht mit einer Lösung von Succinimidyl-2-(2-pyridyldithio)ethylcarbonat (SDEC, hergestellt unter Verwendung früherer Protokolle) umgesetzt wurden55 ), gelöst in DMF (10 Äquivalente bezogen auf die anfängliche Peptidbeladung auf dem festen Träger), mit N,N-Diisopropylethylamin (5 Äquivalente). Die Perlen wurden anschließend dreimal mit DMF und dann Aceton gewaschen und an der Luft getrocknet, bevor sie mit 95 % Trifluoressigsäure (2,5 % Triisopropylsilan, 2,5 % DiH2O) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur entschützt wurden. Die Trifluoressigsäure wurde mit Stickstoff abgeblasen und Die Perlen wurden in DMF erneut gelöst und durch Glaswolle filtriert. Das Peptidprodukt wurde durch etwa 5–6-fache Zugabe von Diethylether ausgefällt und zur weiteren Ausfällung 1–2 Stunden bei –20 °C belassen. Die Lösung wurde zentrifugiert (2.000 × g, 3 Min.), um das Peptid zu pelletieren, das gesammelt, getrocknet und in DMF gelöst wurde. Reduzierte DNA (0,5 µmol) wurde über Nacht bei Raumtemperatur mit dem gelösten Peptid (5 µmol) in 70–75 % DMF in Wasser für ein Gesamtreaktionsvolumen von ~1,5 ml umgesetzt. Für Peptidkonjugate wurden die Peptide mit 2,2′-Dithiodipyridin (150 µmol), gelöst in 10 Äquivalenten DMF, unter leichtem Rühren für 30 Minuten bei Raumtemperatur aktiviert. Das aktivierte Peptid wurde dann dreimal in Diethylether gewaschen, durch Zentrifugation (2.000 × g, 3 Min.) pelletiert und trocknen gelassen. Reduzierte DNA (0,3 µmol) wurde über Nacht bei RT mit dem gelösten Peptid (1,5 µmol) in ~70 % DMF in Wasser für ein Gesamtreaktionsvolumen von ~1,5 ml umgesetzt.

Nach der Konjugation des Peptids wurden die Lösungen 2 Minuten lang bei 17.000 × g zentrifugiert, um etwaiges präzipitiertes Peptid zu pelletieren, und der Überstand wurde auf 3-kDa-MWCO-Spinfilter übertragen und 3–4 Mal mit DiH2O gewaschen. Das Volumen wurde auf <500 μl konzentriert und die Lösungen wurden durch vorbereitende Denaturierung (8 M Harnstoff) von 15 % PAGE-Gelen (nicht mehr als 0,5 μmol DNA, die auf ein einzelnes Gel geladen wurde) gereinigt. Die Gele wurden 30 Minuten lang bei 175 V, dann etwa 3 Stunden lang bei 350 V betrieben und anschließend mit einer UV-Lampe abgebildet, um die gewünschten Banden auszuschneiden. Ausgeschnittene Gelbänder wurden zerkleinert und das Produkt durch drei Wäschen mit 1x Tris/Borat/EDTA-Puffer alle ca. 4 Stunden gesammelt. Die Produktmasse wurde durch Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS) bestätigt und die Konzentrationen wurden durch UV-Vis bei 260 nm unter der Annahme eines Extinktionskoeffizienten der DNA gemessen.

SNAs wurden wie zuvor berichtet mit geringfügigen Modifikationen synthetisiert. Kurz gesagt, getrocknete Lipidfilme aus 50 mg 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC, Avanti Polar Lipids) wurden mit 3–4 ml PBS oder PBS-haltigem Peptid für eingekapselte Liposomen hydratisiert. (Hinweis: Lösungen, die Peptid enthielten, enthielten OVA1: 1 mg ml-1 gelöst in PBS mit ~100 µl 1 M NaOH; OVA2: 1 mg ml-1 gelöst in PBS mit ~60 µl 1 M NaOH; M27: 2,25 mg ml-1 gelöst in PBS mit ca. 60 µl 1 M NaOH; M30: 1 mg ml−1 gelöst in PBS mit ca. 100 µl 1 M NaOH; AgdpkI: 1 mg/ml gelöst in PBS mit 120 µl 1 M NaOH; Agdpk II: 0,65 mg/ml gelöst in PBS mit 50 μl 1M NaOH.) Die Lösungen wurden 20 Mal in flüssigem Stickstoff eingefroren und anschließend einer Ultraschallbehandlung bei 37–40 °C unterzogen. Die Liposomen wurden mittels sequentieller Hochdruckextrusion (Northern Lipids) unter Verwendung von Polycarbonatfiltern mit Porengrößen von 200, 100, 80 und 50 nm extrudiert; Liposomen wurden dreimal durch jede Porengröße geleitet. Nach der Extrusion wurden die Liposomen unter Verwendung von 100-kDa-MWCO-Spinfiltern auf ~2–3 ml konzentriert und über Nacht gegen 3,5 l PBS dialysiert, um nicht eingekapseltes Peptid zu entfernen. Die Liposomenkonzentration wurde mit einem Phosphatidylcholin-Assay-Kit (Sigma, MAK049-1KT) bestimmt, wobei davon ausgegangen wurde, dass ein 50-nm-Liposom 18.140 Lipide pro Liposom enthält24. Die Peptidkonzentration, wenn in Liposomen eingekapseltes Peptid enthalten war, wurde unter Verwendung eines Pierce-Fluoreszenz-Assay-Kits (ThermoFisher, 23290) bestimmt, wobei 1 % Natriumdodecylsulfat (SDS) hinzugefügt wurde, um Liposomen aufzubrechen und Peptid zur Quantifizierung freizusetzen, und wobei in 1 % SDS gelöstes Peptid als Standard verwendet wurde Kurve. Die Peptidbeladung pro Liposom wurde berechnet, indem die Peptidkonzentration durch die Liposomenkonzentration dividiert wurde. Die Mengen jedes Antigens pro Partikel lagen zwischen etwa 25 und 40, abhängig von der Verkapselungsausbeute jeder Charge, die durch unterschiedliche Ausgangskonzentrationen abgestimmt wurde.

Gereinigte Oligonukleotid-Peptid-Konjugate wurden im Molverhältnis 1:1 mit komplementärer 3'-Cholesterin-terminierter CpG-DNA gemischt und über Nacht zentriviert. Am nächsten Tag wurden etwa 20–40 μl Duplexpuffer (IDT) hinzugefügt und die Lösung wurde langsam abgekühlt, um die Stränge gemäß dem Programm zu duplizieren: 70 °C für 10 Minuten, 23 °C für 1,5 Stunden, 4 °C für 10 Minuten ≥1 Std. Der Duplex wurde zu einer Lösung synthetisierter Liposomen in einer äquimolaren Menge zu dem im Liposom eingekapselten Peptid gegeben. Um maximal 75 Stränge pro Liposom zu erhalten, wurde der verbleibende Raum mit 3'-Cholesterin-terminierter T20-DNA gefüllt. Diese Mischung wurde über Nacht bei 37 °C inkubiert und anschließend bei 4 °C gelagert.

DA-SNAs, die Fluorophor-markierte Antigene enthielten (2 μM in 1,5 ml Volumen), wurden in 50-ml-Falcon-Röhrchen mit einem MWCO von 10 K in das Dialysegerät Slide-A-Lyzer MINI gegeben. Die Falcon-Tube-Lösung bestand aus 10 % fötalem Rinderserum (FBS) in PBS. Die Proben wurden geladen und auf einem Rotator belassen. Zu bestimmten Zeitpunkten wurden 200 μl Probe gesammelt und bis zur Analyse mit einem BioTek-Plattenlesegerät bei –20 °C eingefroren.

Alle Zellen wurden in einem Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 °C gehalten. E.G7-OVA, MC-38 und DCs wurden mit RPMI 1640-Medium (Gibco, 11875093) kultiviert, das 10 % hitzeinaktiviertes (HI)-FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin enthielt, hierin als RPMI+/+ bezeichnet. B16-F10 wurden unter Verwendung von DMEM-Medien (Gibco, 11965092) gehandhabt, die 10 % HI-FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin enthielten.

Knochenmarkszellen wurden von Mäusen nach einem früheren Protokoll gesammelt55. Kurz gesagt, rote Blutkörperchen wurden mit 2–3 ml ACK-Lysepuffer (Gibco, A1049201) etwa 4 Minuten lang lysiert und auf 10-cm2-Zellkulturschalen mit 40 ng ml-1 Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (BioLegend, 576304) ausplattiert ) für 5–7 Tage vor der Verwendung, um DCs von der Population zu unterscheiden.

Die Zellen wurden aus 10-cm2-Zellkulturschalen gesammelt und DCs wurden aus der Mischung unter Verwendung eines magnetischen Biotin-Positivselektionskits (Stemcell Technologies, 17665) isoliert. Ein CD11c+-Biotin-markierter Antikörper wurde zur Auswahl von DCs (BioLegend) verwendet und nach der Trennung wurden die gereinigten DCs mit einem Vi-CELL BLU-Zelllebensfähigkeitsanalysator gezählt. Zur DC-Aktivierung wurden 6 × 104 DCs mit SNA-Behandlung in einem Endvolumen von 200 μl für einen 30-minütigen Puls kultiviert. Die Zellen wurden dann zweimal mit RPMI+/+ gewaschen und 22 Stunden lang in einem Inkubator belassen. Anschließend wurden die Zellen zum Abschluss der Behandlung mit PBS gewaschen und 15 Minuten lang bei 4 °C unter Verwendung von 0,5 μl jedes Antikörpers pro Röhrchen gefärbt (L/D, CD11c, CD86 und CD80), mit PBS gewaschen und mit 100 μl Fixierungspuffer (BioLegend, 420801) fixiert. Für Studien mit einem MHC-I-Blocker wurden die Zellen zunächst 30 Minuten lang in einem Volumen von 100 μl mit 25 μg ml-1 Anti-MHC-I (BioXCell, E0077) inkubiert. Anschließend wurden der Zell- und Blockerlösung SNAs in einem Volumen von 100 μl zugesetzt und die Proben 30 Minuten lang gepulst. Die restlichen Schritte folgen dem obigen Protokoll. Um die T-Zell-Spezifität und -Aktivierung zu beurteilen, wurden 1,6 × 105 gereinigte DCs 30 Minuten lang mit SNA-Behandlung im Inkubator in einem Endvolumen von 200 μl gepulst. Nach dem 30-minütigen Puls wurden die Zellen zweimal mit RPMI+/+ gewaschen, um etwaige restliche SNAs aus der Zelllösung zu entfernen, und die Zellen wurden in 500 μl RPMI+/+ resuspendiert. Gleichzeitig wurden Splenozyten aus einer naiven Maus isoliert. Nach der Dissoziation der Milz und der Lyse der roten Blutkörperchen wurden die Zellen gezählt und auf eine Konzentration von 3 × 106 Zellen pro ml in erwärmtem RPMI+/+ resuspendiert, und 100 μl dieser Zelllösung wurden in jede Vertiefung in einem 96er-Reagenzglas überführt -Well-Rundbodenplatte. In jede Vertiefung wurden 100 μl behandelte DCs (3,3 × 104 Zellen) gegeben, sodass das Verhältnis von DC:Splenozyten 1:9 betrug. Die Zellen wurden 3 Tage lang im Inkubator kokultiviert, anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen und gemäß den Anweisungen des Herstellers entweder für das DimerX Mouse H-2Kb:Ig Fusion Protein (BD, 552944) oder OVA2 Tetramer (ProImmune) gefärbt. Zu den färbenden Antikörpern gehörten zusätzlich zu den peptidspezifischen TCR-Markern L/D, entweder CD8 oder CD4, CD19 und CD69. Nach der Färbung wurden die Zellen mit 100 µl Fixierungspuffer fixiert. Um die T-Zell-Proliferation zu beurteilen, wurden 2,6 × 105 gereinigte DCs 30 Minuten lang mit SNA-Behandlung im Inkubator in einem Endvolumen von 200 μl gepulst. Nach dem 30-minütigen Puls wurden die Zellen zweimal mit RPMI+/+ gewaschen, um jegliches restliches SNA aus der Zelllösung zu entfernen, und die Zellen wurden in 266,6 μl RPMI+/+ resuspendiert. Gleichzeitig wurden Splenozyten aus einer C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J (OT1)-Maus (Jackson, 003831) isoliert. Nach der Dissoziation der Milz und der Lyse der roten Blutkörperchen wurden die Zellen gezählt und auf eine Konzentration von 4 × 107 Zellen pro ml in PBS resuspendiert, um sie anschließend mit dem Zellproliferationsfarbstoff eFluor 450 (eBioscience, 65-0842-85) anzufärben die Anweisungen des Herstellers. Nach der Färbung wurden die Zellen gewaschen, gezählt und in RPMI+/+ auf eine Konzentration von 3 × 106 Zellen pro ml resuspendiert; 100 μl dieser Zelllösung wurden in jede Vertiefung einer 96-Well-Rundbodenplatte überführt. In jede Vertiefung wurden 33,3 μl behandelte DCs (3,3 × 104 Zellen) gegeben, sodass das Verhältnis von DC:Splenozyten 1:9 betrug, und jede Vertiefung wurde mit Medium auf ein Endvolumen von 200 μl gebracht. Die Zellen wurden 3 Tage lang im Inkubator kokultiviert, anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen, auf CD8 gefärbt (0,5 μl Antikörper pro Röhrchen), gewaschen und sofort mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung einer Verdünnung von eFluor 450 als Maß für T-Zellen analysiert Proliferation. Alle Proben wurden mit einem BD A3 Symphony-Durchflusszytometer analysiert, wobei die Daten auf FlowJo analysiert wurden.

Weibliche C57BL/6-Mäuse wurden alle zwei Wochen dreimal mit verschiedenen Behandlungen subkutan immunisiert. Die Behandlungen umfassten: einfache Mischung (Mischung, 6 nmol jedes Peptids und 6 nmol CpG 1826-DNA), entweder DA-SNA (6 nmol OVA-Peptid und CpG 1826) oder gleichwertige separate Formulierungen von entweder DA-SNA (6 nmol OVA-Peptid und CpG 1826) oder eine doppelt hybridisierte DA-SNA (genannt „HH“; 6 nmol OVA-Peptid und 12 nmol CpG 1826). Das injizierte Behandlungsvolumen wurde bei 100 μl gehalten. Eine Woche nach der letzten Immunisierung wurden die Mäuse getötet und die Milz für die anschließende Immunbewertung entnommen.

Entnommene Milzen wurden gesammelt und vorübergehend in 3–5 ml RPMI+/+ gehalten, bis alle Milzen gesammelt waren. Anschließend wurden sie durch ein 70-μm-Zellsieb mit einem konstanten PBS-Fluss geleitet. Die Zellen wurden 5 Minuten lang bei 1.200 U/min zentrifugiert, danach wurde der Überstand entfernt und die Zellen 4 Minuten lang in 2–3 ml ACK-Lysepuffer (Gibco, A1049201) resuspendiert. Um den Lysepuffer zu verdünnen, wurde dann PBS auf ein Endvolumen von 30 ml zugegeben und die Zellen wurden vor der Zentrifugation gezählt, um sie in RPMI+/+-Medium bei einer Konzentration von 1 × 108 Zellen pro ml zu resuspendieren.

T-Zellen wurden ex vivo restimuliert, um die antigenspezifische intrazelluläre IFN-γ-Produktion zu bewerten. Splenozyten (4 × 106) wurden 4 Stunden lang bei 37 °C in einem 5 % CO2-Inkubator mit 450 μl RPMI+/+-Medium kultiviert, das entweder OVA1- oder OVA2-Peptid (10 μg ml−1), Monensin (2 μM), Brefeldin A (5 μg ml−1) und CD107a-Antikörper (0,5 μl). Nach der 4-stündigen Inkubation wurden die Zellen 5 Minuten lang bei 1.200 U/min zentrifugiert, abgesaugt und mit 600 μl PBS gewaschen, bevor sie 15 Minuten lang mit Oberflächenantikörpern (jeweils 0,5 μl pro Probe von: L/D, CD8 und CD4) bei 4 °C gefärbt wurden C. Die Zellen wurden mit 600 μl PBS gewaschen, 5 Minuten lang bei 1.200 U/min zentrifugiert, abgesaugt und in 100 μl Cytofix-Fixierungs- und Permeabilisierungslösung (BD, 554722) 20 Minuten lang bei 4 °C resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen mit 600 μl Perm/Waschpuffer (BD, 554723) gewaschen, 5 Minuten lang bei 1.200 U/min zentrifugiert, abgesaugt und in 100 μl Perm/Waschpuffer mit dem intrazellulären Antikörper IFN-γ (0,5 μl pro Probe) resuspendiert ). Die Proben wurden vor der durchflusszytometrischen Analyse bei 4 ° C gelagert.

T-Zellen wurden auf ihren Effektor-Gedächtnis-Phänotyp untersucht. Splenozyten (3 × 106) wurden mit 600 μl PBS gewaschen und 15 Minuten lang mit Oberflächenantikörpern (jeweils 0,5 μl pro Probe von: L/D, CD8, CD4, CD44 und CD62L) bei 4 °C gefärbt. Die Zellen wurden mit 600 μl PBS gewaschen, 5 Minuten lang bei 1.200 U/min zentrifugiert, abgesaugt, in 100 μl Fixierungspuffer (BioLegend, 420801) resuspendiert und vor der Durchflusszytometrieanalyse bei 4 °C gelagert.

Die ELISpot-Analyse wurde mit dem im Handel erhältlichen Maus-INF-γ-ELISPOT-Set (BD, 551083) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt, die bereitgestellte saubere Platte wurde über Nacht bei 4 °C mit Fängerantikörper beschichtet. Anschließend wurde die Platte mit RPMI+/+-Medium gewaschen und dann 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit 200 μl RPMI+/+-Medium blockiert. Der Blockierungspuffer wurde durch Pipettieren entfernt, wobei darauf zu achten war, dass die Vertiefungen nicht austrockneten, und schnell durch 2 × 105 Splenozyten in 100 μl RPMI+/+ ersetzt. In jede Vertiefung wurden zusätzlich 100 μl entweder Antigen, unspezifisches Peptid, Medien (Negativkontrolle) oder Positivkontrolllösungen gegeben (Antigen und unspezifisches Peptid wurden bis zu einer Endkonzentration von 5 μg ml–1 hinzugefügt; Positivkontrolle). wurde als Mischung aus Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern in einer Endkonzentration von jeweils 2 μg ml−1 hergestellt. Die Lösungen wurden 48 Stunden lang in einem Inkubator bei 37 °C in 5 % CO2 belassen. Nach dieser Inkubation wurde die Platte gewaschen und Nachweisantikörper, Enzymkonjugat und chromogenes Substrat gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzugefügt. Die getrocknete Platte wurde mit einem CTL Immunospot-Imager abgebildet und analysiert.

Um die Aufnahme und den intrazellulären Transport von DA-SNAs zu bewerten, wurden BMDCs aus murinen Femuren gesammelt und auf CD11c+ gereinigt (wie oben beschrieben) und anschließend auf 8-Kammer-Objektträgern (Lab-Tek, 155409) mit 50.000 Zellen pro Vertiefung ausgesät. Nach der Inkubation über Nacht wurden die Zellen entweder 0,5, 1, 6 oder 24 Stunden lang mit DA-SNAs (2,5 μM) behandelt, die Fluorophor-markierte OVA1- und OVA2-Antigene enthielten. Für 6 und 24 Stunden wurden die Zellen 2 Stunden lang mit DA-SNAs gepulst und für die verbleibende Zeit durch frisches Medium ersetzt. Nach der Inkubation zu den angegebenen Zeitpunkten wurden die Zellen dann 15 Minuten lang fixiert (BioLegend) und 1 Stunde lang mit 5 % BSA (ThermoFisher) in PBS mit 0,1 % Triton-X blockiert. Anschließend wurden die Zellen mit Primärantikörpern für EEA1 (Verhältnis 1:700, Abcam), Rab7 (1:500, Abcam), LAMP1 (1:200, ABclonal), PDI (1:50, Cell Signaling) und MHC auf Organellenmarker gefärbt -I (1 μg ml−1, BioXCell) und MHC-II (1 μg ml−1, BioXCell) über Nacht bei 4 °C vor der sekundären Markierung mit Alexa Fluor 555 (EEA1, Rab7, LAMP1 und PDI; Abcam ab150078) und Alexa Fluor 594 (MHC-I und MHC-II; ThermoFisher A48264) für 1 Stunde bei 4 °C. Zellkerne wurden 1 Minute lang mit DAPI angefärbt und bis zur Bildgebung in PBS gelagert. Die Bildgebung wurde mit einem Zeiss LSM 800-Mikroskop durchgeführt, wobei für alle Bilder die gleichen Parameter beibehalten wurden. Der Überlappungskoeffizient von Mander wurde mit der ZEN-Software (Zeiss) berechnet. Für Inhibitorstudien (einschließlich derjenigen, die mittels Durchfluss durchgeführt wurden) wurden 150.000 Zellen pro Vertiefung ausgesät. Nach der Inkubation über Nacht wurden die Zellen 1 Stunde lang mit Chloroquin (5 μM, Sigma), Brefeldin A (2 μg ml−1, BioLegend) oder Leupeptin (100 μM, Sigma) inkubiert. Nach einer einstündigen Inkubation wurden Medien, die DA-SNA (2,5 μM) und die angegebenen Inhibitoren enthielten, hinzugefügt und eine weitere Stunde lang gepulst. Nach dem Pulsieren mit DA-SNAs wurden die Vertiefungen mit Medien gewaschen und anschließend für eine Gesamtinkubationszeit von 24 Stunden durch Medien mit Inhibitoren ersetzt. Die Organellenfärbung wurde wie oben beschrieben durchgeführt.

Dendritische Zellen, CD4+- und CD8+-T-Zellen wurden aus ganzen Splenozyten einzelner Behandlungsgruppen nach drei alle zwei Wochen stattfindenden subkutanen Immunisierungen mit magnetisch-positiven Selektionskits (Stemcell Technologies, 17665, 18952 und 18953) isoliert. Aus diesen isolierten Zellpopulationen wurde die RNA-Extraktion mit einem RNeasy Plus Mini-Kit (Qiagen) in Kombination mit QIAshredders (Qiagen) gemäß den Herstellerangaben durchgeführt. Die RNA-Konzentration wurde mit einem NanoDrop 8000 (ThermoFisher) quantifiziert und die RNA-Proben wurden bis zur weiteren Verwendung bei –80 ° C gelagert. Die Sequenzierung wurde an der NUSeq Core Facility der Northwestern University durchgeführt. Kurz gesagt, die Gesamt-RNA-Beispiele wurden mithilfe von RNA-Integritätszahlen (RINs), die mit dem Agilent Bioanalyzer 2100 generiert wurden, auf Qualität überprüft. Die RNA-Menge wurde mit einem Qubit-Fluorometer bestätigt. Das Illumina TruSeq Stranded mRNA Library Prepared Kit wurde zur Vorbereitung von Sequenzierungsbibliotheken aus 125 ng hochwertigen RNA-Proben (RIN > 7) verwendet. Das Kit-Verfahren, einschließlich mRNA-Reinigung und -Fragmentierung, cDNA-Synthese, 3'-End-Adenylierung, Illumina-Adapter-Ligation, Bibliotheks-PCR-Amplifikation und -Validierung, wurde ohne Änderungen durchgeführt. Bibliotheken wurden mit einem Illumina HiSeq 4000-Sequenzer sequenziert, um 50-bp-Einzellesevorgänge mit einer Tiefe von 20–25 Millionen Lesevorgängen pro Probe zu generieren. Die Qualität der Lesevorgänge im FASTQ-Format wurde mit FastQC bewertet. Die Lesevorgänge wurden mit cutadapt57 gekürzt, um Illumina-Adapter von den 3'-Enden zu entfernen. Zugeschnittene Messwerte wurden mithilfe von STAR58 auf das Mus-musculus-Genom (mm10) ausgerichtet. Die Lesezahlen für jedes Gen wurden unter Verwendung von htseq-count59 in Verbindung mit einer Genannotationsdatei für mm10 berechnet, die von Ensembl (http://useast.ensembl.org/index.html) bezogen wurde. Normalisierung und Differentialexpression wurden mit DESeq2 berechnet, das den Wald-Test60 verwendete. Der Grenzwert für die Bestimmung signifikant unterschiedlich exprimierter Gene war ein an die Falscherkennungsrate (FDR) angepasster P-Wert von weniger als 0,05 unter Verwendung der Benjamini-Hochberg-Methode.

GSEA61 wurde durchgeführt, um zu verstehen, ob unterschiedlich exprimierte Gene mit unterschiedlich angereicherten Signalwegen verbunden sind. Mit der RNA-Sequenzierung erkannte Gene wurden auf der Grundlage der log10-transformierten nominalen P-Werte aus der DeSeq2-Analyse eingestuft und mit naiven T-Zellen verglichen. Die Pathway-Anreicherungsanalyse wurde mit der GSEA-Software (v4.0.3) und nach dem Protokoll in Lit. durchgeführt. 62. Gensätze wurden aus der Molecular Signatures Database bezogen und umfassten Reactome und KEGG. Die Rangliste wurde mithilfe einer CHIP-Technologie aus der Molecular Signatures Database neu zugeordnet, die das Maus-Gensymbol zur Neuzuordnung zu menschlichen Orthologen (v7.1) verwendete. Ein Begriff wurde als differenziell angereichert definiert, wenn er einen FDR < 0,05 hatte. Eine Teilmenge stark angereicherter Pfade wurde für die Visualisierung in R mithilfe des Pheatmap-Pakets (v1.0.12) ausgewählt. Diese Auswahl umfasste alle Signalwege mit einem FDR < 0,05 und war für Immunantworten in dendritischen, CD8+- und CD4+-T-Zellen relevant.

Gene, deren Expression in beiden SNA-Behandlungsgruppen gemäß FDR P < 0,05 signifikant verändert war, wurden zur Visualisierung als Heatmaps ausgewählt. Genexpressions-Scores in FPKM wurden in Z-Scores über Behandlungsgruppen hinweg umgewandelt und Genexpressionswerte mithilfe von K-Means-Clustering geclustert. Paarweise Kombinationen wurden zwischen zwei interessierenden Bedingungen durchgeführt, wobei naive CD4+- oder CD8+-T-Zellen als Kontrollen eingesetzt wurden. Gene, die zwischen den Gruppen nach oben oder unten reguliert wurden, wie durch FDR P < 0,05 und eine log2-fache Änderung von >0,5 (hochreguliert) oder eine log2-fache Änderung <0,05 (herunterreguliert) definiert, wurden mithilfe eines Vulkandiagramms visualisiert.

Weibliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 8–12 Wochen wurden vom Jackson Laboratory erworben. Die Tumorimpfung erfolgte durch subkutane (sc) Injektion von entweder 5 × 105 E.G7-OVA-, 105 B16-F10- oder 5 × 105 MC-38-Zellen in die rechte Flanke der Tiere. Die Impfungen wurden in einer Dosis von entweder 6 nmol (OVA1/2 und Adpgk I/II) oder 9 nmol (M27/30) jedes Antigens und CpG durch subkutane Injektion in den Bauch verabreicht. Die Impfungen wurden wie im Behandlungsplan in den jeweiligen Abbildungen aufgeführt verabreicht. Zur Kombinationstherapie mit dem Immun-Checkpoint-Inhibitor Anti-PD-1 wurden Mäusen 100 μg Anti-Maus-PD-1 (Klon RMP1-14, BioXCell) per intraperitonealer Injektion verabreicht. Das Tumorwachstum wurde an vorher festgelegten Tagen gemessen und das Volumen anhand der folgenden Gleichung berechnet: Tumorvolumen = Länge × Breite2 × 0,5. Die Tiere wurden eingeschläfert, wenn das Tumorvolumen entweder 2.000 mm3 (E.G7-OVA) oder 1.500 mm3 (B16-F10, MC-38) erreichte oder wenn das Tier sterbend war.

Die biologische Verteilung von DA-SNAs auf Hauptorgane wurde bei weiblichen C57BL/6-Mäusen (n = 3) unter Verwendung von Fluorophor-markierten OVA-Peptiden und einer Einzeldosis von 6 nmol sc durchgeführt. Nach 24 Stunden wurden ganze Organe gesammelt und kurz in PBS gelagert abgebildet. Die Bildgebung wurde mit einem In Vivo Imaging System (IVIS) mit Anregungs-/Emissionsfiltern durchgeführt, die auf 500/540 (FITC) und 640/680 (Cy5) eingestellt waren. Hybridisierte Antigene wurden mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cy5 markiert, während eingekapselte Antigene mit dem Fluoreszenzfarbstoff FITC markiert wurden. Die Daten wurden durch Messung mit der Living Image-Software v4.5 quantifiziert. Aus der Bioverteilungsanalyse entnommene Milzen wurden nach der Bildgebung durch ein 70-μm-Zellsieb zerstampft. Die Zellen wurden 5 Minuten lang bei 1.200 U/min pelletiert und die Zellen 4–5 Minuten lang in ACK-Lysepuffer (Gibco) resuspendiert. Die Zellen wurden in PBS auf ~25–30 ml verdünnt und gezählt. Drei Millionen Zellen wurden in Durchflussrohre gegeben und mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit Färbelösung, die jeweils 0,5 μl von: fixierbarem lebendem/totem UV und CD11c (Klon N418, PE) enthielt, 15 Minuten lang bei 4 °C in 100 μl PBS inkubiert. Der Überstand wurde nach Waschen und Zentrifugieren entfernt und die Zellen wurden in 100 μl Fixierungspuffer (BioLegend, 420801) fixiert und vor der Durchflusszytometrie bei 4 ° C gelagert.

Zur Sammlung von PBMCs wurden die Tiere wie oben beschrieben mit Krebszellen geimpft. Die Behandlung erfolgte nach dem gleichen Zeitplan und die Tiere wurden am 15. (E.G7-OVA), 16. (MC-38) oder 17. Tag (B16-F10) eingeschläfert. Das Blut wurde über eine Herzpunktion in mit EDTA ausgekleideten Sammelröhrchen (BD) gesammelt und durch Umdrehen kurz gemischt. Rote Blutkörperchen wurden unter Verwendung von ACK-Lysepuffer (Gibco) lysiert und gewaschen, und die verbleibenden Zellen wurden anschließend unter Verwendung der oben beschriebenen Methoden mit Antikörpern für L/D, CD4, CD8, CD19, CD44, CD62L und antigenspezifischem Dimer oder Pentamer gefärbt und Tetramer (E.G7-OVA, B16-F10) oder L/D, CD8, CD19 und antigenspezifisches Pentamer (MC-38).

Tumorgewichte und Splenozytenbewertung wurden an C57BL/6-Mäusen durchgeführt, die einen E.G7-OVA-Tumor in der rechten Flanke trugen. 3 Tage nach der Tumorimpfung wurde die erste Immunisierung verabreicht, gefolgt von einer zusätzlichen Dosis 7 Tage später (Tag 10). Die Tumoren und Milzen wurden den Tieren am 15. Tag entnommen und anschließend analysiert. Die Bewertung der Tumormikroumgebung wurde an C57BL/6-Mäusen durchgeführt, die einen MC-38-Tumor in der rechten Flanke trugen. 3 Tage nach der Tumorimpfung wurde die erste Immunisierung verabreicht, gefolgt von einer zusätzlichen Dosis 7 Tage später (Tag 10). Am 16. Tag wurden den Tieren Tumore entnommen und anschließend analysiert. Um Einzelzelllösungen zu erzeugen, wurden Tumore mechanisch durch ein 70-μm-Zellsieb gedrückt, während die Hydratation in PBS-Lösung aufrechterhalten wurde. Anschließend wurden die Zellen 5 Minuten lang bei 1.200 U/min zentrifugiert. Das Milzpellet wurde 4 Minuten lang in ACK-Lysepuffer (ThermoFisher) resuspendiert, um rote Blutkörperchen zu lysieren, und anschließend vor der Zentrifugation in PBS neutralisiert. Nach der Zentrifugation wurden die Zellen mit den folgenden Antikörpern markiert: E.G7-OVA: CD4, CD8, CD19 und L/D; MC-38: CD4, CD8, CD45, CD11b, Gr-1 und L/D.

Die Statistiken wurden mit der GraphPad Prism 9-Software berechnet und die verwendeten spezifischen statistischen Analysen werden in den jeweiligen Bildunterschriften hervorgehoben. Vergleiche zwischen mehreren Gruppen wurden mit einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) mit einem Šidák- oder Tukey-Mehrfachvergleichstest oder einer Welch-ANOVA mit einem Dunnett-Mehrfachvergleichstest analysiert, da es an Annahmen mangelte, die auf der Grundlage großer Unterschiede getroffen werden könnten in SD zwischen Gruppen. Statistiken zum Überleben der Tiere wurden mithilfe eines Log-Rank-Tests berechnet. Ausreißer für Abb. 5e,f und Abb. 6h,j wurden mit der ROUT-Methode identifiziert, wobei Q auf 10 % bzw. 1 % eingestellt wurde. Für alle Fälle werden die P-Werte wie folgt dargestellt: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 und ****P < 0,0001. Die Zuordnung der Tiere zu den einzelnen Gruppen, die verabreichten Impfungen und die Messungen für die Studien erfolgten blind. Werte in Diagrammen werden als Mittelwert ± Standardabweichung oder Standardabweichung dargestellt und dieser sowie die Stichprobengrößen sind in den jeweiligen Bildunterschriften angegeben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Papier und seinen ergänzenden Informationen verfügbar. Alle in dieser Studie generierten Daten sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Dieses Material basiert auf Arbeiten, die vom Polsky Urologic Cancer Institute des Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center der Northwestern University am Northwestern Memorial Hospital, Edward Bachrach und dem National Cancer Institute der National Institutes of Health mit den Auszeichnungen R01CA208783, R01CA257926 und P50CA221747 unterstützt wurden. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health wieder. MHT dankt für die Unterstützung durch den Cancer Nanotechnology Training Program Award T32CA186897 der Northwestern University. ME wurde teilweise vom Dr. John N. Nicholson Fellowship und der Alexander S. Onassis Public Benefit Foundation unterstützt. Die Peptidsynthese wurde, mit besonderem Dank an M. Karver, in der Peptide Synthesis Core Facility des Simpson Querrey Institute an der Northwestern University durchgeführt, die derzeit von der Soft and Hybrid Nanotechnology Experimental (SHyNE) Resource (NSF ECCS-2025633) unterstützt wird. Für diese Arbeit wurde die IMSERC MS-Einrichtung der Northwestern University genutzt, mit besonderem Dank an S. Shafaie; Diese MS-Einrichtung wurde von der Soft and Hybrid Nanotechnology Experimental (SHyNE) Resource (NSF ECCS-2025633), dem Bundesstaat Illinois und dem International Institute for Nanotechnology (IIN) unterstützt. Diese Arbeit wurde von der NUSeq Core Facility der Northwestern University unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Michelle H. Teplensky, Michael Evangelopoulos.

Abteilung für Chemie und Internationales Institut für Nanotechnologie, Northwestern University, Evanston, IL, USA

Michelle H. Teplensky, Connor M. Forsyth und Chad A. Mirkin

Abteilung für Biomedizintechnik, Northwestern University, Evanston, IL, USA

Michael Evangelopoulos, Jasper W. Dittmar, Andrew J. Sinegra und Chad A. Mirkin

Interdisziplinäres Programm für Biowissenschaften, Northwestern University, Evanston, IL, USA

Connor M. Forsyth, Shuya Wang und Chad A. Mirkin

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MHT, ME und CAM haben die Experimente entworfen. MHT, ME, JWD, CMF und SW führten die Experimente durch. MHT und AJS analysierten Sequenzierungsdaten. MHT und ME analysierten alle anderen Daten, die alle Autoren überprüften. MHT, ME und CAM haben den ersten Entwurf des Manuskripts geschrieben. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft und bearbeitet.

Korrespondenz mit Chad A. Mirkin.

CAM und MHT haben finanzielle Interessen an Flashpoint Therapeutics Inc., die möglicherweise von den Ergebnissen dieser Forschung profitieren könnten.

Nature Biomedical Engineering dankt Jeffrey Hubbell und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a: Expression kostimulierender Marker in dendritischen Zellen mit verschiedenen Konzentrationen und mehreren Peptidsätzen sowie mit MHC-I-Blocker. Legende für die verschiedenen Behandlungen in dieser Studie. b, Die Expression (gemessen durch die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI)) von CD80 (links) und CD86 (rechts) auf CD11c + DCs basierend auf der Abgabe der beiden Antigenklassen entweder auf separaten Nanopartikeln oder einer einzelnen DA-SNA. Es wurde eine Reihe von Konzentrationen (nach CpG und jedem Antigen) getestet. c: Die Zugabe eines Anti-MHC-I-blockierenden Antikörpers zu den dendritischen Zellen führte insgesamt nicht zu einer großen Änderung des MFI des CD80- (links) oder CD86-Signals (rechts). Alle Fold-Changes bei MFIs liegen bei etwa 1, was darauf hindeutet, dass es keinen Unterschied gibt. d, Expression von CD80 (links) und CD86 (rechts) mit SNA-Formulierungen, die M27- und M30-Neoantigene enthalten. Für alle Panels wird der Mittelwert ± Standardabweichung für n = 3 angezeigt. Statistische Signifikanz zwischen relevanten Vergleichen unter Verwendung der Zwei-Wege-ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest.

a: In-vivo-Immunantworten, die auf der Grundlage der Antigenplatzierung und -formulierung ausgelöst werden, einschließlich einer doppelt hybridisierten (HH) kombinierten Nanostruktur. Zeitplan für die alle zwei Wochen stattfindende Immunisierung für C57BL/6-Mäuse. Dosis: 6 nmol jedes Antigen; 6 nmol Adjuvans. Verschiedene Impfgruppen in der Legende dargestellt. b, Veränderung der CD8+- (links) oder CD4+-Zellpopulationen (rechts) in der Milz nach dem Impfschema. c: Die intrazelluläre Produktion des proinflammatorischen Zytokins IFN-γ (links) oder des CD107a-Degranulationsmarkers (Mitte) wurde nach Ex-vivo-Restimulation mit Peptidantigen beurteilt; CD8+ T-Zellanalyse mit OVA1-Stimulation (oben), CD4+ T-Zellanalyse mit OVA2-Stimulation (unten). Polyfunktionelle T-Zellen (doppelt positiv für beide Marker) wurden quantifiziert (rechts). d, Effektor-Gedächtnis-Phänotyp, gemessen durch CD44+CD62L−-Marker. e, Prozentsatz der CD8+ T-Zellen, die OVA1-spezifisch sind, gemessen durch Färbung mit einem Antigen-spezifischen Dimer. Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt; n = 3-6 Mäuse pro Gruppe. Die statistische Signifikanz zwischen relevanten Vergleichen wird angezeigt. Für alle Panels wurde die Signifikanz mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Tukey (b, c, d) oder Dunnett (e) berechnet.

ac, C57BL/6-Mäuse wurden subkutan mit MC-38-Zellen (5 × 105) in der rechten Flanke geimpft und erhielten ab Tag 3 wöchentliche Immunisierungen für insgesamt vier Impfungen (6 nmol Adjuvans, 6 nmol jedes Antigens). Dargestellt sind durchschnittliche Tumorwachstumskurven, Tumorvolumen am Tag 24 und Überleben der Tiere. df, Durchflusszytometrische Analyse von Zellen, die am Tag 16 aus Tumoren isoliert wurden und den in a angegebenen Zeitplan erhielten. d, Bewertung von CD8+- und e, CD4+-T-Zellen unter CD45+-Immunzellen. f, Bewertung von Gr-1+CD11b+ myeloischen Suppressorzellen in CD45+-Immunzellen. g, Durchflusszytometrische Analyse von PBMCs am Tag 16, die aus tumortragenden Mäusen gemäß dem in a dargestellten Schema isoliert wurden. CD8+ T-Zellen, die für das Adpgk 1-Antigen spezifisch sind. h, Gesamtzahl der fleckbildenden Zellen (SFCs), gemessen durch den ELISpot-Assay (links) von IFN-γ-sekretierenden Milz-T-Zellen nach verschiedenen Ex-vivo-Stimulationen. Repräsentative Zählungen und Bilder (rechts). Eine unspezifische Antigen-Ex-vivo-Stimulation führte zu keinen SFCs, was die Spezifität der Reaktion unterstreicht. Für AC zeigen die Daten den Mittelwert ± Standardabweichung aus zwei unabhängigen Experimenten (n = 6–9). Für dh zeigen die Daten einen Mittelwert ± SEM mit n = 6 pro Gruppe, wobei einige Gruppen weniger individuell angezeigte Punkte aufwiesen, wenn an Tag 16 keine Tumoren vorhanden waren. Für die Panels b, dg wurde die Signifikanz mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA mit Tukey berechnet Mehrfachvergleichstest. Für Panel h wurde die Signifikanz aufgrund signifikanter Unterschiede zwischen den Gruppen in der Standardabweichung mithilfe einer Welch-ANOVA und anschließend eines Dunnett-Mehrfachvergleichstests berechnet. Das Überleben der Tiere in Panel c wurde mithilfe eines Log-Rank-Tests analysiert. ns = nicht signifikant.

Quelldaten

Ergänzende Abbildungen, Tabellen und Referenzen.

RNAseq für dendritische Zellen sowie GSEA- und Genberichte.

T-Zell-RNAseq- und GSEA-Berichte.

T-Zell-RNAseq und Liste der signifikanten Gene.

Quelldaten für die Tumorwachstumskurven.

Springer Nature oder sein Lizenzgeber (z. B. eine Gesellschaft oder ein anderer Partner) besitzen die ausschließlichen Rechte an diesem Artikel im Rahmen einer Veröffentlichungsvereinbarung mit dem Autor bzw. den Autoren oder anderen Rechteinhabern. Die Selbstarchivierung der akzeptierten Manuskriptversion dieses Artikels durch den Autor unterliegt ausschließlich den Bedingungen dieser Veröffentlichungsvereinbarung und geltendem Recht.

Nachdrucke und Genehmigungen

Teplensky, MH, Evangelopoulos, M., Dittmar, JW et al. Multi-Antigen-Krebsimpfstoffe mit sphärischer Nukleinsäure. Nat. Biomed. Eng (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-022-01000-2

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Eingegangen: 02. September 2021

Angenommen: 19. Dezember 2022

Veröffentlicht: 30. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-022-01000-2

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