Kugelförmiges Rotationszellen-Aussaatsystem für die Produktion von Kleinstzellen

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 3001 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Für den klinischen Einsatz wurden zuvor vollständig biologische menschliche Blutgefäße aus Gewebezüchtung (TEBV) entwickelt. Gewebezüchtungsmodelle haben sich auch als wertvolle Werkzeuge bei der Krankheitsmodellierung erwiesen. Darüber hinaus besteht Bedarf an TEBV mit komplexer Geometrie für die Untersuchung multifaktorieller Gefäßpathologien, wie z. B. intrakranieller Aneurysmen. Das Hauptziel der in diesem Artikel beschriebenen Arbeit war die Herstellung eines vollständig menschlichen, verzweigten TEBV mit kleinem Kaliber. Die Verwendung eines neuartigen kugelförmigen rotierenden Zellaussaatsystems ermöglicht eine effektive und gleichmäßige dynamische Zellaussaat für ein lebensfähiges In-vitro-Tissue-Engineering-Modell. In diesem Bericht wird der Entwurf und die Herstellung eines innovativen Säsystems mit zufälliger sphärischer 360°-Rotation beschrieben. Maßgeschneiderte Saatkammern werden im Inneren des Systems platziert und enthalten Y-förmige Gerüste aus Polyethylenterephthalatglykol (PETG). Die Aussaatbedingungen wie Zellkonzentration, Aussaatgeschwindigkeit und Inkubationszeit wurden durch die Zählung der an den PETG-Gerüsten anhaftenden Zellen optimiert. Diese sphärische Aussaatmethode wurde mit anderen Ansätzen wie dynamischer und statischer Aussaat verglichen und zeigt deutlich eine gleichmäßige Zellverteilung auf PETG-Gerüsten. Mit diesem einfach zu verwendenden kugelförmigen System wurden auch vollständig biologisch verzweigte TEBV-Konstrukte hergestellt, indem menschliche Fibroblasten direkt auf speziell angefertigte PETG-Dornen mit komplexer Geometrie gesät wurden. Die Herstellung patienteneigener kleinkalibriger TEBVs mit komplexer Geometrie und optimierter Zellverteilung entlang des rekonstruierten Gefäßes könnte eine innovative Möglichkeit zur Modellierung verschiedener Gefäßerkrankungen wie intrakranieller Aneurysmen sein.

Die Weiterentwicklung von durch Gewebezüchtung hergestellten Gefäßtransplantaten in den letzten Jahren stellt eine vielversprechende klinische Option für die Behandlung von Gefäßerkrankungen oder die Bereitstellung alternativer In-vitro-Modelle zur Untersuchung dieser komplexen Erkrankungen dar1,2. Durch Modellverfeinerung ist es nun möglich, vom Patienten stammende gewebetechnisch hergestellte Blutgefäße (TEBV) mit definierten genetischen Hintergründen herzustellen, um die Pathobiologie hinter Gefäßerkrankungen besser zu verstehen3,4. Im Laufe der Jahre wurden verschiedene Techniken zur Erzeugung von TEBVs entwickelt, die jeweils Vor- und Nachteile aufweisen und in drei Hauptkategorien eingeteilt werden können: (1) Gefäßleitungen aus Zellen, die auf hergestellten Gerüsten ausgesät werden, (2) Gefäßleitungen aus Zellblättern Ingenieurwesen und (3) Bioprinting5,6. Eine der Herausforderungen beim vaskulären Tissue Engineering besteht jedoch immer noch darin, die Aussaat, Verteilung und Organisation der Zellen zu verbessern, um Zellen homogen in eine röhrenförmige Struktur einzubinden. Folglich haben sich dynamische Zellaussaattechniken gegenüber einfacheren statischen Ansätzen durchgesetzt7,8,9. Darüber hinaus ist in einer dreidimensionalen (3D) Umgebung eine gleichmäßig überwachte Zellverteilung erforderlich, um eine homogene Gewebeumgestaltung zu fördern und die Konkurrenz um Nährstoffe in Bereichen mit höherer Zelldichte zu vermeiden10,11,12,13. Der aktuelle Stand der dynamischen Zellaussaat ermöglicht eine einfache Produktion von linearem TEBV mithilfe von Rollflaschen und der perfundierten Aussaat von Endothelzellen in einem röhrenförmigen Konstrukt. Diese sind jedoch nicht ideal für die Herstellung eines dreischichtigen TEBV mit komplexerer Geometrie, bestehend aus einer Adventitia, einer Media und einer Intima tunica4,14,15,16.

Zuvor wurde gezeigt, dass die Herstellung selbstorganisierter linearer Blutgefäße kleinen Kalibers, die auf Polyethylenterephthalat-Glykol (PETG) gesät und mit ultravioletten C-Strahlen (UV-C) vorbehandelt wurden, eine ordnungsgemäße Zellanbindung und eine optimierte Sekretion der extrazellulären Matrix (ECM) gewährleistet. Montage14. Um TEBVs mit komplexer Geometrie herzustellen und die Zellaussaat entlang der Gerüste zu verbessern, haben wir ein Rotationssystem mit einer zufälligen Rotationsbewegung entwickelt, die eine effektive und gleichmäßige Zellverteilung ermöglicht. Wir beschreiben hier den Entwurf und die Herstellung eines innovativen Rotationssaatsystems, das eine vollständige 360°-Rotation durchführen und vollständig biologische verzweigte gewebetechnisch hergestellte Gefäßadventitien (TEBV-A) produzieren kann.

Die ersten Vorgaben für die Konzeption dieses neuartigen Rotationssäsystems waren eine 360°-Rotation mit einstellbarer Geschwindigkeit, eine Betriebszeit von mindestens 24 Stunden und eine Produktionskapazität von maximal fünf TEBVs gleichzeitig. Das Design wurde einfach, unkompliziert und benutzerfreundlich gestaltet (Abb. 1A). Dieses Modell umfasst eine Acrylkugel aus zwei Hälften, die durch zwei Motoren auf einer Trägerplatte in eine sphärische Rotationsbewegung versetzt werden, sodass TEBVs in den Saatkammern produziert werden können, die in der Mitte der Kugel gehalten werden (Abb. 1B–E). Dieses Säsystem wurde so angepasst, dass es eine zufällige 360°-Rotation aufweist. Die Drehung gilt als zufällig, da die konstante Geschwindigkeit der Motoren während der gesamten Säzeit verwendet wird und die Unvollkommenheiten in der Kugelform Änderungen in der Bewegungsachse verursachen (Zusatzvideo 1). Das System verfügt außerdem über eine einstellbare Geschwindigkeit von 63 bis 135°/Minute, eine Betriebszeit von mehr als 24 Stunden und eine Produktionskapazität von fünf TEBVs (Abb. 1F). Es kann für die Dauer des Aussaatschritts auch in eine Umgebung mit kontrollierbarer Temperatur gebracht werden.

Rotationssaatsystem. (A) Computergestützter Entwurf (CAD) des Systems mit CREO 5.0-Software mit Richtungsanzeigern; (B,C) Fotos der männlichen und weiblichen Hälften der Acrylkugel mit 3D-gedrucktem Verschlussring und Platten, um die Saatkammern an Ort und Stelle zu halten; (D) Aluminium-Trägerplatte mit drei kugelgelagerten Stützen, zwei Motoren und einer elektronischen Steuereinheit; (E) fünf maßgeschneiderte Acrylzell-Impfkammern; (F) Zusammengebautes Rotationssaatsystem. Maßstabsbalken = 5 cm.

Maßgeschneiderte Aussaatkammern wurden entwickelt, um menschliche Fibroblastenzellen auf verzweigten PETG-Gerüsten auszusäen (Abb. 2). Die Kammern bestehen aus zwei Polycarbonathälften mit individuell gefertigten Y-förmigen Vertiefungen, die für die Aufnahme Y-förmiger PETG-Gerüste mit 4,8 mm Durchmesser geeignet sind (Abb. 2A–C). Diese Gerüste bestehen aus drei separaten Teilen, die durch Edelstahlstifte zusammengehalten werden, sodass die verschiedenen Zweige zur einfachen Demontage entfernt werden können. Die untere Hälfte verfügt über einen Y-förmigen O-Ring, um die Kammer wasserdicht zu machen, und die obere Hälfte verfügt über drei kleine Öffnungen, die das Hinzufügen von Zellen und Kulturmedien ermöglichen (Abb. 2A). Die beiden Hälften werden mit Edelstahlbeschlägen zusammengehalten. Alle für die Kammern verwendeten Teile können durch Autoklavieren sterilisiert und dann unter einer biologischen Haube unter aseptischer Technik zur Aussaat menschlicher Zellen verwendet werden (Abb. 2D). Fünf der geschlossenen Saatkammern müssen innerhalb des Rotationssystems platziert werden, damit die Kugel ordnungsgemäß funktionieren kann (Abb. 2E).

Maßgeschneiderte verzweigte Saatkammern. (A) CAD des Systems mit CREO 5.0-Software der Saatkammer aus Acryl in der unteren Hälfte mit Y-förmiger Vertiefung und Y-förmigem O-Ring; (B) CAD eines kundenspezifischen Y-förmigen PETG-Gerüsts mit Passstiften aus Edelstahl; (C) CAD der kompletten, mit Hardware verschlossenen Säkammer und Ansicht der kleinen Schrauben für die Säöffnungen; (D) Foto aller Teile und Hardware der Saatkammern innerhalb der biologischen Haube auf einem sterilen Feld; (E) Foto der kompletten, mit Hardware verschlossenen Kammer und Ansicht der kleinen Schrauben für die Saatöffnung. Maßstabsbalken = 1 cm.

Um die optimalen Parameter für die Zellaussaat zu ermitteln, haben wir zunächst verschiedene Zellkonzentrationen getestet. Drei anfängliche Zellkonzentrationen, hier angegeben in Millionen Zellen pro Milliliter Kulturmedium (M/ml), wurden verwendet (0,1 M/ml, 0,15 M/ml und 0,30 M/ml), um die Kammern zu besäen. Man ließ die Zellen 22 Stunden lang bei einer mittleren Geschwindigkeit von 90°/min an einem PETG-Dorn mit 4,8 mm Durchmesser haften. Mit Zellen besäte Mandrels wurden dann 10 Minuten lang mit Trypsin inkubiert und die abgelösten Zellen wurden gezählt. Es wurde festgestellt, dass eine Zellkonzentration von 0,15 M/ml der beste Parameter für die Zellaussaat ist (0,15 M/ml im Vergleich zu 0,1 M, P < 0,0010; 0,15 M/ml im Vergleich zu 0,3 M/ml, P = 0,3805) (Abb. 3A). ). Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den Bedingungen hinsichtlich der Anzahl der Zellen im Überstand nach der Aussaat beobachtet (Abb. 3A). Anhand dieser optimalen Zellkonzentration wollten wir dann die beste Aussaatgeschwindigkeit bestimmen, d. h. die optimale Geschwindigkeit zum Aufbau des kugelförmigen Rotationssystems, das es der größtmöglichen Anzahl von Zellen ermöglicht, am Gerüst zu haften. Es wurden drei verschiedene Aussaatgeschwindigkeiten getestet (63°/min, 90°/min und 135°/min). Es wurde festgestellt, dass die Anzahl der am PETG-Gerüst haftenden Zellen bei Verwendung der mittleren Aussaatgeschwindigkeit von 90°/min deutlich höher war (63°/min im Vergleich zu 90°/min; P = 0,0321 und 90°/min im Vergleich zu 135°). /min; P = 0,0119) (Abb. 3B). Für die Anzahl der Zellen im Überstand nach der Zellaussaat wurde kein signifikanter Unterschied beobachtet (Abb. 3B). Nach der Zellaussaat in den Kammern wurden auch unterschiedliche Inkubationszeiten getestet (4 h, 8 h, 16 h und 22 h). Eine Inkubationszeit von 22 Stunden erwies sich hier als der beste Parameter, da im Vergleich zu jeder anderen getesteten Inkubationszeit mehr Zellen am Gerüst hafteten (P < 0,0001). Darüber hinaus wurden im Überstand nach 4 Stunden Aussaat mehr Zellen gezählt als zu jedem anderen Zeitpunkt (P < 0,0001), was darauf hindeutet, dass die Zellen nicht die Zeit hatten, richtig am Gerüst zu haften, und sich noch im Kulturmedium befanden (Abb. 3C). ). Insgesamt lagen die optimalen Zellaussaatparameter bei 0,15 M/ml Zellen bei einer Geschwindigkeit von 90°/min für 22 Stunden bei 37 °C.

Anzahl der an den Gerüsten und im Überstand haftenden Zellen in Abhängigkeit von der Zellkonzentration, der Geschwindigkeit des Aussaatsystems und der Inkubationszeit. (A) Drei Zellkonzentrationen in Millionen Zellen pro Milliliter Medium (M/ml) wurden durch Aussaat von Zellen bei 90°/Minute für 22 Stunden bewertet; (B) drei Systemgeschwindigkeiten (°/min) wurden durch Aussaat von 0,15 M/ml Zellen für 22 Stunden bewertet; (C) Vier Inkubationszeiten (Stunden) wurden durch Beimpfen mit 0,15 M/ml bei 90°/min analysiert. Für statistische Analysen wurde eine zweifaktorielle ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest durchgeführt. Diagramm (A–C) zeigt Box und Whiskers mit Max. und Min. n = 4–5/Gruppe. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 und ****P < 0,0001. ns nicht signifikant.

Die neuartige sphärische Seeding-Technik wurde mit einer dynamischen und einer statischen Seeding-Methode verglichen. Erstens kann die Zellverteilung auf PETG-Gerüsten nach der Aussaat mit einer Rhodanilblau-Färbung beobachtet werden (Abb. 4A). Im Vergleich zu anderen Aussaattechniken können bei Verwendung der Kugeltechnik scheinbar gleichmäßige Zellverteilungen auf den Dornen beobachtet werden (Abb. 4A und ergänzende Abb. 1). Darüber hinaus wurde kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen der kugelförmigen Aussaat und den anderen Techniken gemessen, nachdem nach der 22-stündigen Aussaatperiode die richtige Anzahl der an den Gerüsten anhaftenden Zellen gemessen wurde (Abb. 4B). Bemerkenswerterweise war TEBV-A, das mit dem beschriebenen Kugelsystem hergestellt wurde, nach einer Reifezeit von 42 Tagen Kultur nach der ersten Aussaat statistisch gesehen größer als TEBV-A, das mit anderen Aussaattechniken hergestellt wurde (P < 0,05 und P < 0,0001) (Abb. 4C,D), was darauf hindeutet, dass eine gleichmäßige Verteilung für die Produktion von dickerem TEBV-A wichtig sein könnte.

Zellverteilung und Lebensfähigkeit in nachgeimpftem und gereiftem TEBV-A, das durch verschiedene Aussaattechniken hergestellt wurde. (A) Foto von mit Rhodanilblau gefärbten Zellen auf einem PETG-Gerüst nach der Aussaat. Maßstabsbalken = 1 cm; (B) Anzahl der am Gerüst haftenden Zellen nach einer 22-stündigen Aussaatperiode; (C) TEBV-A-Gewebedicken (µm), gemessen nach einer 42-tägigen Reifungszeit; (D) Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) von histologischen Schnitten, die aus gereiftem TEBV-A entnommen wurden und mit verschiedenen Impftechniken (sphärisch, dynamisch und statisch) hergestellt wurden. Maßstabsbalken = 100 µm; (E,F) Lebend/Tot-Assay an nach der Aussaat geernteten TEBV-A-Zellen, analysiert durch Durchflusszytometrie; (G,H) Lebend/Tot-Assay an gereiften TEBV-A-geernteten Zellen. (B,C) Box und Whiskers mit Max. und Min. Für statistische Analysen wurde ein Kruskal-Wallis-Test mit dem Mehrfachvergleichstest von Dunn durchgeführt. n = 4–24. (F,H) Gestapelte Balken mit Standardabweichung. Für statistische Analysen wurde eine zweifaktorielle ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest durchgeführt. n = 5. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 und ****P < 0,0001. ns nicht signifikant.

Ein weiterer wichtiger Aspekt, der hier berücksichtigt und zwischen verschiedenen Aussaatmethoden verglichen werden muss, ist die Lebensfähigkeit der Zellen. Daher wurden durchflusszytometrische Lebend-/Tot-Assays verwendet, um die Lebensfähigkeit der Zellen nach der 22-stündigen Aussaat (Nachaussaat) und der 42-tägigen Reifezeit zu quantifizieren. Es wurde festgestellt, dass die Lebensfähigkeit nach der Aussaat bei Verwendung des kugelförmigen Aussaatsystems im Vergleich zu anderen Aussaatmethoden deutlich höher war; dynamisch (P <0,001) und statisch (P <0,001) (Abb. 4E, F und ergänzende Abb. 2A). Obwohl erheblich geringer, wurde jedoch nach der Reifungsperiode von 42 Tagen nach der Aussaat bei keiner der getesteten Aussaattechniken ein Unterschied in der Lebensfähigkeit der Zellen gemessen (Abb. 4G, H und ergänzende Abb. 2B). Die in reifem TEBV-A gemessene geringere Lebensfähigkeit der Zellen könnte hier einfach durch den 30-minütigen enzymatischen Verdau erklärt werden, der erforderlich ist, um die Zellen aus dem ECM für die Durchflusszytometrieanalyse zu ernten; Dieser Schritt ist in der Zeit nach der Aussaat nicht erforderlich. Insgesamt wurden mit dem entwickelten sphärischen Rotationssystem im Vergleich zu anderen dynamischen und statischen Aussaattechniken eine gleichmäßigere Zellverteilung, ein dickeres TEBV-A sowie eine verbesserte Lebensfähigkeit der Zellen gemessen.

Vollständig biologisch verzweigtes TEBV-A, hergestellt aus menschlichen Fibroblasten, wurde unter Verwendung der vorgegebenen optimalen Zellaussaatparameter hergestellt. Nach einer Inkubationszeit der Zellaussaat von 22 Stunden wurden die Aussaatkammern aus dem System demontiert. Die mit Zellen besäten Gerüste wurden dann in Kulturplatten gegeben und 42 Tage lang in Kultur gehalten. Die Gewebedicke wurde mit einem Lasermikrometer an jedem Ast gemessen (Abb. 5A). Für alle drei Zweige der TEBVs wurde kein statistisch signifikanter Unterschied gefunden, was auf eine gleichmäßige Zellverteilung entlang der gesamten geimpften Dorne hinweist (Abb. 5A, B). Um TEBVs mit komplexer Geometrie wie Y-förmigen Gerüsten herzustellen, war es in der Tat entscheidend, ein Zellsaatsystem zu entwickeln, das eine gleichmäßige Zellverteilung entlang der Gerüste und insbesondere an der Verzweigungs-/Verbindungsstelle ermöglicht. Das verzweigte TEBV-A zeigte alle makroskopisch gleichmäßig verteilte Zellen an der kritischen Verbindungsstelle (Abb. 5C, D). Darüber hinaus wurden die Gewebedicken anhand histologischer Querschnitte der Äste und Verbindungsstellen gemessen (Abb. 5E, F), und es wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede festgestellt (Abb. 5G).

Makroskopische und mikroskopische Charakterisierung des verzweigten TEBV-A, das mit dem entwickelten Rotationssaatsystem erzeugt wurde. (A) Foto eines TEBV-A mit „Y“-Geometrie auf einem verzweigten PETG-Gerüst; (B) Gewebedicke der drei Zweige (I, II, III) von TEBV-A in µm. N = 4, n = 4; (C) Nahaufnahme der TEBV-A-Verbindung auf dem Gerüst (D) und vom Gerüst abgeschnitten; (E) H&E-Färbung des Zweigs und (F) Verbindung der vom Gerüst abgeschnittenen TEBV-A-Probe; (G) Gewebedicke histologischer Abschnitte der Zweige und der Verbindung von TEBV-A in µm. n = 12. Pfeile zeigen die Verbindungsstelle. Für statistische Analysen wurde ein Kruskal-Wallis-Test mit Dunns Mehrfachvergleichstest für Diagramm (B) und ein Welch-t-Test für Diagramm (G) durchgeführt. Grafik (B,G) zeigt Streudiagramm mit Balken und Standardabweichung. Maßstabsbalken = 100 µm. ns nicht signifikant.

In diesem Artikel ist es uns gelungen, ein rotierendes kugelförmiges Zellaussaatsystem zu entwerfen und zu bauen, das in der Lage ist, biologische TEBVs mit kleinem Kaliber und komplexer Geometrie zu produzieren, die vollständig aus menschlichen Zellen bestehen. Die Zellaussaatparameter wurden optimiert, um die Zellverteilung und -adhärenz entlang der gesamten Gerüstbereiche zu verbessern, selbst am kritischen Verzweigungs-/Verbindungspunkt der entworfenen „Y“-förmigen TEBVs für den Proof-of-Concept. Im Vergleich zu anderen dynamischen und statischen Aussaatansätzen ermöglicht unsere neuartige kugelförmige Aussaatmethode eine gleichmäßigere Verteilung der Zellen entlang des gesamten produzierten TEBV, zeigte eine höhere Lebensfähigkeit der Zellen nach der Aussaat und produzierte dickeres Gewebe. Das beschriebene System umfasste individuell gefertigte und leicht sterilisierbare Saatkammern mit UV-C-behandelten PETG-Gerüsten, die so konzipiert waren, dass sie in die Saatkammern passen. Bemerkenswert ist, dass Saatkammern leicht mit anderen Geometrien/Spezifikationen umgestaltet werden können, um sich an unterschiedliche Blutgefäßformen, -größen und -winkel an der Gabelung anzupassen.

Eine Zellkonzentration von 0,15 M/ml während der ersten Aussaat der Kammern, kombiniert mit einer zufälligen Rotation in alle Richtungen (x, y und z) für 22 Stunden bei einer Geschwindigkeit von 90°/min, erwiesen sich als optimale Aussaatparameter um die Zelladhärenz und -verteilung entlang des PETG-Gerüsts zu begünstigen. Nach der 22-stündigen Inkubationszeit in den Impfkammern wurden die mit Zellen besäten Gerüste aus den Kammern entfernt und 42 Tage lang in Kulturmedium kultiviert, um die ECM-Produktion, den Zusammenbau und die Reifung von TEBVs zu fördern. Die Kinetik der Wechselwirkungen zwischen Zellen und festen Gerüsten folgte dem Langmuir-Modell, dessen drei Annahmen an die Zellkultur angepasst wurden: (i) Zellen können sich nicht anlagern, um mehr als eine Monoschicht zu bilden; (ii) Zellen können sich an allen Oberflächen des Gerüsts anlagern; (iii) Zellen können unabhängig von bereits anhaftenden Zellen am Gerüst haften, bis eine Monoschicht erreicht ist17,18. Es ist bekannt, dass die UV-C-Behandlung von PETG die Zellhaftung fördert, indem sie die Carbonylgruppen des Kunststoffs modifiziert, was wiederum die hydrophilen Eigenschaften des Materials verstärkt14,19,20,21. In Übereinstimmung mit der Langmuir-Theorie erleichtert die Rotationsbewegung des beschriebenen dynamischen Aussaatsystems Zell-Gerüst-Wechselwirkungen auf der gesamten Oberfläche des behandelten Kunststoffdorns und ermöglicht so eine bessere Zellanhaftung und -verteilung7,8,22. Tatsächlich ermöglichte die zufällige 360°-Bewegung dieses neuartigen Systems den Zellen, während der Aussaatphase auf alle Teile des Gerüsts mit komplexer Geometrie zu treffen. Dies wurde durch die gleichmäßigen Gewebedicken angezeigt, die entlang der Äste des „Y“-förmigen TEBV gemessen wurden. Langmuirs dritte Annahme impliziert, dass Zellen, sobald eine Monoschicht erreicht ist, aufhören, sich unabhängig an das Gerüst anzuheften, und beginnen, mit anderen befestigten Zellen zu interagieren. Dieser Anstieg der Zell-Zell-Wechselwirkungen im Laufe der Zeit könnte die Ablösung der Zellen vom Gerüst gefördert haben und erklären, warum gleiche oder weniger Zellen aus PETG mit einer höheren Zelldichte entnommen wurden, wodurch effektiv ein Plateau erreicht wurde17,21.

Die mittlere Geschwindigkeit des Systems wurde für die Zellaussaat mit 90°/min als optimal angesehen. Während alle getesteten Geschwindigkeiten relativ niedrig waren, musste das System schnell genug sein, um die Zellen während der gesamten Dauer der Aussaat im Medium schweben zu lassen, aber langsam genug, damit die Zellen richtig interagieren und sich am Kunststoff festsetzen konnten. Außerdem war eine längere Aussaatdauer von 22 Stunden erforderlich, um die Zellanhaftung zu erhöhen. Auch bei anderen Modellen hat sich gezeigt, dass langsame Geschwindigkeiten über einen längeren Zeitraum eine bessere Zellanhaftung fördern23,24. Zellaussaatparameter wie Geschwindigkeit, Zelldichte und -zeit hängen vom Zelltyp ab (Zell-Gerüst-Wechselwirkung, Zellanhaftung, Matrixproduktionskapazität) und müssen daher für jedes Gewebezüchtungsmodell und jeden auszusäenden Zelltyp optimiert werden9 ,25,26,27,28. Wir haben die Sedimentationsgeschwindigkeit (V) innerhalb der Impfkammern für die getestete Fibroblastenpopulation auf 2,5 µm/s geschätzt und dabei das Stokessche Gesetz der Strömungsmechanik V = (g(ρp − ρf)d2)/18μ verwendet, das unter Verwendung der folgenden Konstanten berechnet wurde: ( Schwerkraft (g: 9,81 m/s2), Zelldichte (ρp: 1050 kg/m3), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)-Dichte (ρf: 1007 kg/m3), Fibroblastenzelldurchmesser (d: 10 µm) und DMEM-Viskosität (μ: 0,00093 Pa s)29,30. Obwohl langsam, ermöglicht diese Sedimentationsrate der Fibroblasten in Kombination mit der zufälligen Rotationsbewegung der Kugel für 22 Stunden trotz der Komplexität der Geometrie eine gleichmäßige Zellverteilung auf dem Gerüst innerhalb der rotierenden Impfkammern30 ,31.

Der Einsatz von Bürstenmotoren, um die Kugel in einer zufälligen 360°-Rotation bei niedriger Geschwindigkeit zu drehen, ist mit einigen Einschränkungen verbunden, da sie das Maximum ihrer Kapazität erreicht hat. Die Umrüstung auf Servomotoren würde eine präzisere Drehung ermöglichen und gleichzeitig das Risiko beseitigen, dass die Motoren aufgrund von Überhitzung, erhöhtem Widerstand und Spannungsabfall von selbst anhalten. Dieses Rotationszellen-Aussaatsystem verwendet ein Potentiometer, um die Spannung an den Motoren zu regulieren und die Drehzahl vorzugeben. Die Hinzufügung eines Mikrocontrollersystems und einer elektronischen Anzeige würde eine bessere Spannungsanpassung und eine präzisere Rotationsgeschwindigkeit während der Zellaussaat ermöglichen.

Im Vergleich zu anderen Aussaattechniken ermöglichte die entwickelte Methode des kugelförmigen Aussaatsystems eine gleichmäßige Zellverteilung auf PETG-Gerüsten sowie die Produktion von dickerem, ausgereiftem TEBV-A nach 42 Tagen Zellkultur, unabhängig von der Anzahl der Zellen, die ursprünglich während der Aussaatperiode an den Gerüsten hafteten . Eine gleichmäßigere Zellverteilung kann dann die Gewebereifung unterstützen und folglich die ECM-Sekretion und -Zusammensetzung verbessern32,33,34. Es hat sich gezeigt, dass Zell-Zell- und Zell-ECM-Wechselwirkungen im Tissue Engineering bei der Krankheitsmodellierung erforderlich sind, um die Wechselwirkung zwischen Zellen, Gewebezusammensetzungen und der Mikroumgebung im Zusammenhang mit komplexen menschlichen Pathologien besser darzustellen11,35,36.

Obwohl ein vollständiges TEBV-Modell eine Adventitia (Fibroblasten), Media (glatte Muskelzellen) und Intima tunica (Endothelzellen) umfasst, entwickelt sich der aktuelle Stand der verzweigten TEBV-Modelle rasch von verzweigten Gefäßprothesen über verzweigte Gefäßstents in der Klinik bis hin zu verzweigten Kollagenröhrchen mit Endothelzellen und zu 3D-gedruckten verzweigten Gefäßtransplantaten4,37,38,39. Nach unserem besten Wissen sind wir das erste Forschungsteam, das ein rein biologisches kleinkalibriges verzweigtes TEBV-Modell der Adventitia ohne exogenes Material erstellt hat. Besonders interessant ist, dass die kritische Verbindungsstelle intakt blieb und sich nach der Gerüstdemontage nicht ablöste. Dieses innovative System ermöglicht die Herstellung von Geweben mit ausreichender Dicke, die ihre Manipulation, Beobachtung und Untersuchung mit nur einer einschichtigen Fibroblastenschicht ermöglichen, obwohl diese noch nicht perfundiert werden kann. Mehrere aufeinanderfolgende Zellaussaaten könnten der nächste geeignete Schritt sein, um dickere mehrschichtige TEBVs herzustellen40.

Die Herstellung patienteneigener kleinkalibriger TEBVs mit komplexer Geometrie könnte eine innovative Möglichkeit zur Modellierung verschiedener Gefäßerkrankungen sein. Beispielsweise wären die konstruierten Y-förmigen TEBVs ein einzigartiges In-vitro-Modell zur Untersuchung intrakranieller Aneurysmen (IA), die bei betroffenen Personen hauptsächlich in den Gabelungen des Willis-Kreises auftreten41,42. IA ist eine zerebrovaskuläre Erkrankung, bei der eine Schwäche der Wand der Gehirnblutgefäße zu einer lokalen Ballonbildung führt43. IAs weisen nach ihrem Bruch eine Sterblichkeitsrate von 50 % und eine Morbiditätsrate von 30–50 % bei den Überlebenden auf44. Die Verwendung von Y-förmigen TEBVs, die in einem Bioreaktor kultiviert werden und die Erzeugung eines künstlichen, aber physiologischen Blutflusses ermöglichen, wird für die Untersuchung von IA und Hämodynamik von besonderem Interesse sein. Da die genetische Komponente von IAs noch nicht sehr gut verstanden ist, wären mehrschichtige und verzweigte TEBVs, die von Patienten stammen und vollständig wiederhergestellte Blutgefäße mit Intima, Media und Adventitia produzieren, auch für die Untersuchung pathogener und pathophysiologischer IA-assoziierter Mechanismen von großem Interesse.

Abschließend stellten wir ein innovatives rotierendes Zellsaatsystem vor, das einfach zu verwenden, waschbar und sterilisierbar ist und die Herstellung von fünf kleinkalibrigen röhrenförmigen TEBVs der Adventitia mit komplexer Geometrie ermöglicht. Insgesamt wurden das Saatsystem und die Kammern so konzipiert und maßgeschneidert, dass sie einfach zu bedienen sind. Das beschriebene System wird daher erhebliche Auswirkungen auf die zukünftige Forschung haben, wenn man bedenkt, dass eine gleichmäßige Verteilung der Zellen entlang der Gerüste während der Zellaussaat für die 3D-Kultur und das Tissue Engineering von entscheidender Bedeutung ist.

Die Software CREO 5.0 (PTC, Boston, MA, USA) wurde verwendet, um CAD für das Saatsystem vor dem Bau zu erstellen (Abb. 1A). Die Kugel wurde aus zwei Hälften einer Acrylhohlkugel mit 10 Zoll Durchmesser (California Quality Plastics, Ontario, CA, USA) hergestellt (Abb. 1B, C). Zwei 3D-gedruckte Verschlussringe wurden aus 1,75 mm PETG-Filament (Filaments.ca, Mississauga, ON, Kanada) hergestellt, auf einem H800 3D-Drucker (Afinia, Chanhassen, Minnesota, USA) gedruckt und mit Silastic™ Medical auf die Kugelhälften geklebt Elastomerqualität (Dupont, Wilmington, NC, USA). Die Verschlussringe werden durch Edelstahl-Halbrundkopf-Sechskantschrauben (McMaster-Carr, Chicago, IL, USA) zusammengehalten, die in den männlichen PETG-Ring eingeschraubt und im weiblichen PETG-Ring verriegelt werden. 3D-gedruckte Platten wurden wie zuvor beschrieben konzipiert und gedruckt, um die Saatkammern an Ort und Stelle zu halten. Die Platten wurden mit 3D-gedruckten Stützen an der Kugel befestigt, die mit Silastic™ in die Mitte der Kugelhälfte geklebt wurden. Um sicherzustellen, dass die Säkammern an Ort und Stelle bleiben, während sich das System dreht, wurde der Druck über korrosionsbeständige Edelstahlfedern (McMaster-Carr) aufgebracht. Die Trägerplatte wurde aus einer Aluminiumlegierung 6061-T6 (Acier Picard, Levis, QC, Kanada) mit einer 3-Achsen-Fräsmaschine (Fryer Machine Systems, Patterson, NY, USA) hergestellt (Abb. 1d). Zwei DC-Bürstenmotoren 12 V, 10 U/min (RobotShop, Mirabel, QC, Kanada) wurden senkrecht zueinander platziert, um die Rotationsbewegung für das System bereitzustellen. Zwei Motorhalterungen und drei Aluminium-Kugellagerstützen wurden speziell angefertigt und an der Platte befestigt. In den Stützlagern wurden korrosionsbeständige Edelstahlkugeln platziert, um eine ordnungsgemäße Rotation der Kugel zu gewährleisten und zusätzliche Unterstützung zu bieten (McMaster-Carr). Die elektronischen Komponenten zur Stromversorgung und Steuerung der Geschwindigkeit wurden in einer 3D-gedruckten PETG-Box untergebracht. Die Motoren wurden an separate 3-Positionsschalter, ein 25-k-Potentiometer, einen linearen Spannungsregler (Digi-Key, Thief River Falls, Min, USA) und ein AC/DC-5-V-Netzteil für medizinische Zwecke (Newark, Mississauga, ON, Kanada) angeschlossen ), der an eine normale 125-V-Steckdose angeschlossen werden kann. Alle Fotos und Videos wurden mit der iPhone 12 Minikamera (Apple, Cupertino, CA, USA) aufgenommen.

Die Software CREO 5.0 (PTC) wurde auch verwendet, um CAD für die Saatkammern zu erstellen (Abb. 2A–C). Die Kammern bestanden aus zwei unterschiedlichen, maßgeschneiderten Polycarbonathälften (Groupe PolyAlto, Quebec, QC, CA). Mit der dreiachsigen Fräsmaschine (Fryer Machine Systems) wurden in beide Hälften Y-förmige Vertiefungen geschnitten. Die untere Hälfte war von einem Y-förmigen Hochtemperatur-O-Ring aus weichem Silikon mit einer Breite von 3/32 (McMaster-Carr) umgeben, um die Säkammerhälften untereinander abzudichten (Abb. 2D). Die obere Hälfte wurde mit drei Öffnungen hergestellt, die als Saatöffnungen dienen und mit Hochtemperatur-O-Ringen aus weichem Silikon, 3/64 Teilbreite und 18-8 Edelstahl-Kegelspitzen-Stellschrauben, M4 × 0,7 mm Gewinde, 4 abgedichtet sind mm lang (McMaster-Carr). Die zerlegbaren Y-förmigen Gerüste wurden mit einer 5-Achsen-Fräsmaschine (Fryer Machine Systems, Patterson, NY, USA) aus PETG-Stäben mit 4,8 mm Durchmesser (McMaster-Carr) maßgeschneidert geschnitten und durch 18-8 Edelstahldübel zusammengehalten Stifte, 1/32 Zoll Durchmesser, 1/4 Zoll lang (McMaster-Carr). Diese Gerüste werden in der Mitte der Saatkammern innerhalb der Y-förmigen Vertiefung platziert, und die beiden Hälften werden zusammengefügt und mit Sechskantschrauben aus Edelstahl 316, M4 × 0,7 mm-Gewinde, 16 mm lang, vollständig verschlossen Allzweck-Unterlegscheiben aus Edelstahl 316 für M4-Schraubengröße, 4.300 mm Innendurchmesser, 8 mm Außendurchmesser und Sechskantmuttern aus Edelstahl 316, superkorrosionsbeständig, M4 × 0,7 mm-Gewinde (McMaster-Carr) (Abb. 2E). Alle Fotos wurden mit der iPhone 12 Mini-Kamera (Apple) aufgenommen.

Menschliche Hautfibroblasten wurden wie zuvor beschrieben45 isoliert und in DMEM (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) kultiviert, das 10 % fötales Rinderserum (FBS; VWR, Radnor, PA, USA), 100 IE/ml Penicillin G und 25 μg/ml enthielt Gentamicin (Sigma-Aldrich, Kawasaki, OL, Japan). Die Verwendung menschlicher Zellen wurde vom Ethikforschungsausschuss der CHU de Quebec genehmigt (Protokollnummer: 1115C und 1115D) und die Person wurde nach informierter Einwilligung auf freiwilliger Basis rekrutiert. Die Zellen wurden mit 10 ml DMEM-Kulturmedium in die Kammern gesät, die UV-C-behandelte PETG-Stäbe (McMaster-Carr) mit einem Durchmesser von 4,8 mm enthielten. Impfkammern wurden in das Rotationssaatsystem eingesetzt und für nachfolgende Experimente auf 37 °C gehalten. Die UV-C-Behandlung wurde wie zuvor beschrieben für 30 Minuten pro Seite (90°-Drehung) durchgeführt und dann mit 0,2 % Gelatine (Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) beschichtet14. Um die optimale Zellkonzentration für die anfängliche Aussaat zu bestimmen, wurden drei Bedingungen getestet (0,10, 0,15 und 0,30 M/ml) und in die Zellkammern gegeben und dann 22 Stunden lang bei mittlerer Geschwindigkeit in das Rotationssystem gegeben. Außerdem wurden drei verschiedene Rotationsgeschwindigkeiten getestet, um die Zellaussaatparameter besser zu optimieren. Die Kammern wurden mit Fibroblasten (0,15 M/ml) geimpft und 22 Stunden lang in der rotierenden Kugel mit einer Rotationsgeschwindigkeit von 63°, 90° oder 135°/Minute installiert. Diese Geschwindigkeiten wurden als die minimal, median und maximal erreichbaren Geschwindigkeiten angesehen durch die Kugel. Es wurden auch verschiedene Inkubationszeiten nach der Zellaussaat getestet. Die Impfkammern wurden mit Fibroblasten (0,15 M/ml) geimpft und 4, 8, 16 und 22 Stunden lang mit einer Rotationsgeschwindigkeit von 90°/Minute in die Kugel gegeben.

Die Überstände wurden gewonnen und am Ende jeder dieser Inkubationszeiten 10 Minuten lang bei 300 × g zentrifugiert. Die in den Überständen verbleibenden nicht gebundenen und zentrifugierten Zellen wurden in 1 ml DMEM-Medium resuspendiert und unter Verwendung eines Zellzählers (Beckman Coulter, Pasadena, CA, USA) gezählt. Mit Zellen besäte PETG-Stäbe oder Y-förmige Gerüste wurden zunächst 10 Minuten lang mit Trypsin 0,05 % (Fisher Scientific)/EDTA 0,01 % (Teknisciences, Terrebonne, QC, Kanada) inkubiert, um die Zellablösung zu ermöglichen, und dann bei 300 × g zentrifugiert für 10 Min. Die gewonnenen Zellen wurden in 1 ml Medium resuspendiert und dann mit einem Coulter-Zellzähler (Beckman Coulter) gezählt.

Menschliche Hautfibroblasten wurden in DMEM-Medium mit 10 % FBS und dem Antibiotika-Cocktail kultiviert. 0,15 M/ml-Zellen wurden über die Impflöcher in speziell angefertigte Impfkammern ausgesät. Insgesamt 10 ml DMEM-Kulturmedium wurden in die Impfkammern injiziert, die Y-förmige Gerüste aus PETG-Stäben mit 4,8 mm Durchmesser (McMaster-Carr) enthielten. PETG-Gerüste wurden mit UV-C vorbehandelt und dann wie zuvor beschrieben mit 0,2 % Gelatine (Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) beschichtet14. Für die kugelförmige Aussaat wurden die geimpften Kammern dann 22 Stunden lang bei 90 °C/Minute in einem Raum mit 37 °C in die Kugel gelegt. Zur dynamischen Aussaat wurden die ausgesäten Kammern 22 Stunden lang in einem Inkubator mit 37 °C und 8 % CO2 auf einen Orbitalschüttler (BlotBoy, Benchmark Scientific, Sayreville, NJ, USA) gestellt. Für die statische Aussaat wurden die Kammern für die 22-stündige Aussaatperiode direkt in einen Inkubator mit 37 °C und 8 % CO2 gestellt. Anschließend wurden mit Zellen besäte Gerüste gewonnen und für 42 Tage in einem Inkubator bei 37 °C und 8 % CO2 in eine 500-cm2-Zellkulturplatte mit DMEM-Kulturmedium, ergänzt mit 50 μg/ml Ascorbinsäure (Sigma), gegeben. Das Medium wurde alle 2–3 Tage gewechselt und die Gerüste wurden jeden Tag beim Wechsel des Kulturmediums um 180° gedreht.

Makroskopische Bilder von mit Zellen besäten Y-förmigen PETG-Gerüsten wurden mit der iPhone 12 Mini-Kamera (Apple) aufgenommen. Die Gewebedicken auf den drei verschiedenen Zweigen des Y-förmigen Gerüsts wurden mit einem hochpräzisen Lasermikrometer (Keyence, Mississauga, ON, Kanada) gemessen. Für die statistische Analyse wurden vier verschiedene Messungen an jedem Zweig von vier verschiedenen Y-förmigen TEBVs verwendet. TEBVs wurden über Nacht in 3,7 % Formalin fixiert (ChapTec, Montreal, QC, Kanada). Vor der histologischen Analyse wurden auch makroskopische Fotos der biopsierten TEBV-Verbindungsstellen gemacht. Anschließend wurden fixierte 10-μm-TEBV-Querschnitte mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) wie zuvor beschrieben angefärbt36. Mikroskopische Bilder wurden unter Hellfeldbedingungen mit einem aufrechten Mikroskop (AxioImager.M2; Carl Zeiss Microscopy, Jena, TH, Deutschland) aufgenommen und gemessen. Zur Verteilungsanalyse wurden die geimpften Gerüste 30 Minuten lang in 3,7 %igem Formalin fixiert, dann 15 Minuten lang in Rhodanilblau-Färbung gelegt und dann abgespült, bevor sie trocknen ließen, bevor makroskopische Fotos von allen Seiten des Gerüsts gemacht wurden.

Nach den 22-stündigen Aussaatperioden wurden die Überstände gewonnen und für jede Aussaattechnik 10 Minuten lang bei 300 × g zentrifugiert. Mit Zellen besäte PETG-Stäbchen wurden mit Trypsin 0,05 % (Fisher Scientific)/EDTA 0,01 % (Teknisciences) 10 Minuten lang inkubiert, um die Zellen abzulösen, und dann 10 Minuten lang bei 300 × g zentrifugiert. Die aus dem Überstand und den Gerüsten gewonnenen Zellen wurden 15 Minuten lang mit Calcein AM 2,5 nM (Thermo-Fisher) zur Markierung lebender Zellen und Ethidium homodimer-1 4 μM (Thermo-Fisher) zur Markierung toter Zellen inkubiert. Die Zellen wurden sofort mit einem BD FACSMelody™-Durchflusszytometer (BD Biosciences) analysiert und die Daten wurden mit der FlowJo™ v9-Software (Ashland, OR, USA) verarbeitet. Reife Gewebe wurden zunächst aus den Gerüsten gewonnen und 30 Minuten lang bei 37 °C und 300 U/min in eine Verdauungslösung von 5,7 U/ml Kollagenase H (Sigma-Aldrich) in Accutase (Sigma-Aldrich) gegeben. Die Zellen wurden durch ein 40-μm-Zellsieb (Fisher Scientific) filtriert und 10 Minuten bei 300 × g zentrifugiert. Abschließend wurden die Zellen wie unten beschrieben analysiert.

Statistische Analysen wurden mit der Software GraphPad Prism 9.0 (GraphPad, San Diego, CA, USA) durchgeführt. Die in Box- und Whiskers-Diagrammen mit Maximal- und Minimalwerten dargestellten Daten wurden durch eine Zwei-Wege-ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Tukey oder durch den Kruskal-Wallis-Test mit dem Mehrfachvergleichstest von Dunn analysiert. Die im Streudiagramm mit Mittelwert und Standardabweichung (SD) dargestellten Daten wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test mit dem Dunn-Mehrfachvergleichstest oder mit dem Welch-t-Test analysiert. Die von gestapelten Balken mit SD präsentierten Daten wurden durch den Kruskal-Wallis-Test mit dem Mehrfachvergleichstest von Dunn analysiert. Ein P-Wert von < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Die Studie wurde von unseren institutionellen Ethikkommissionen (Ethikforschungsausschuss der CHU de Québec; Protokollnummer 1115 C und 1115 D) genehmigt. Für weitere Informationen wenden Sie sich bitte an ([email protected]). Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit durchgeführt die nationalen Tri-Council Policy Guidelines: Ethical Conduct for Research Involving Humans und genehmigt von der Ethikkommission der CHU de Quebec – University Laval.

Die Einverständniserklärung aller an der Studie beteiligten Probanden wurde auf freiwilliger Basis eingeholt.

Die in dieser Studie präsentierten Daten sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Wir danken Marc-André Campagna, André Chamberland, Patrick Dupuis, Frédéric Morin und Pierre Carrier von der Maschinenbauwerkstatt der Universität Laval. Wir möchten Todd Galbraith, Vincent Clement, Isabella Bienjonetti und Richard Brodeur für technische Unterstützung und wertvolle Ratschläge danken.

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des New Frontiers in Research Fund (NFRF) und der Canadian Institutes of Health Research (CIHR) unterstützt. JR ist Empfänger des NFRF. FG-L. ist Träger der Canada Research Chairs. VR ist Empfänger eines Doktorandenstipendiums des Fonds de la Recherche du Quebec en Santé (FRQS).

Abteilung für Chirurgie, Medizinische Fakultät, Universität Laval, Quebec City, QC, Kanada

Alyssa Brodeur, Vincent Roy, Lydia Touzel Deschênes und François Gros-Louis

Abteilung für Regenerative Medizin, CHU de Quebec Research Center, Laval University, Quebec City, QC, Kanada

Alyssa Brodeur, Vincent Roy, Lydia Touzel Deschênes, François Gros-Louis und Jean Ruel

Fakultät für Maschinenbau, Fakultät für Naturwissenschaften und Ingenieurwesen, Universität Laval, Quebec City, QC, Kanada

Alexandre Winter & Jean Ruel

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Konzeptualisierung, AB, AW, VR, FG-L. und JR; Methodik, AB, AW, VR, LT-D., FG-L. und JR; Software, AB und AW; Validierung, VR, FG-L. und JR; formale Analyse, AB und VR; Untersuchung, AB, AW und LT-D.; Ressourcen, LT-D., FG-L. und JR; Datenkuration, AB und AW; Schreiben – ursprüngliche Entwurfsvorbereitung, AB; Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten, AB, AW, VR, FG-L. und JR; Visualisierung, AB und VR; Supervision, VR, FG-L. und JR; Projektadministration, FG-L. und JR; Finanzierungseinwerbung, FG-L. und JR Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Korrespondenz mit Jean Ruel.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Brodeur, A., Winter, A., Roy, V. et al. Sphärisches rotierendes Zellaussaatsystem zur Herstellung kleinkalibriger, aus Gewebe hergestellter Blutgefäße mit komplexer Geometrie. Sci Rep 13, 3001 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29825-0

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Eingegangen: 08. September 2022

Angenommen: 10. Februar 2023

Veröffentlicht: 21. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29825-0

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